甘松浸膏超聲波萃取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

包秀萍，劉煜宇，連培康，徐蘭蘭，念小魁

(1.云南瑞升煙草技術(shù)(集團)有限公司，云南 昆明 650106，2.江西中煙工業(yè)有限責任公司，江西 330096)

甘松為敗醬科植物NardostachysjatamansiDC.的根及莖[1].是受國家保護的藏藥之一，常用來作為藏醫(yī)、中醫(yī)的藥材[2-4].甘松含有大量的揮發(fā)性萜類成分如倍半萜類、三萜類、環(huán)烯醚萜類等[5-9].近年來，有研究報道，甘松的化學成分主要采用水蒸氣蒸餾萃取獲得揮發(fā)油，將其用于醫(yī)藥臨床的抗菌、鎮(zhèn)靜等方面的研究[10]，而在香精香料領(lǐng)域的研究較少.甘松具有獨特的藥草香、木香和涼香，因此，開發(fā)甘松香料浸膏在香精香料行業(yè)具有較高的應(yīng)用價值和廣泛的前景.

前人針對甘松的研究主要集中在不同產(chǎn)地甘松原料分析和揮發(fā)油的化學成分分析，主要驗證石油醚萃取、水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油在醫(yī)藥中的應(yīng)用研究，但是關(guān)于甘松用于制備香料浸膏的研究較少[11-12].文中采用超聲波輔助萃取法[13-18]對甘松進行乙醇萃取，利用超聲波空化效應(yīng)高效富集甘松中的醇溶性組分，提高萃取率.并通過響應(yīng)面法[19-22]對萃取工藝進行優(yōu)化，運用GC-MS檢測方法[23-27]檢測萃取物中的成分.為開發(fā)具有獨特香韻的甘松香料浸膏提供參考，拓寬甘松在香料領(lǐng)域的應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試劑及原料：甘松(昆明地道中藥飲片廠)，95%酒精、丙二醇(食品級)，二氯甲烷(AR-天津市博迪化工有限公司)，無水硫酸鈉(AR-廣東汕頭市西隴化工廠).

試驗儀器：超聲波輔助萃取設(shè)備(哈爾濱申宜科技有限公司)；SHZ-3型循環(huán)水真空泵，控溫加熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)，GC/MS(HP 6890/5973)分析儀(美國Agilent公司)，同時水蒸氣蒸餾溶劑萃取裝置(SDE)(實驗室自制)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph OB2000)(德國Heidolph公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取粉碎的甘松原料，按照響應(yīng)面實驗設(shè)計條件進行超聲波輔助萃取，萃取液合并，減壓濃縮即得甘松浸膏.

1.2.2 響應(yīng)面法實驗設(shè)計

利用Box-Behnken Design (BBD)進行響應(yīng)面法設(shè)計，以超聲功率A(W)、萃取時間B(min)和乙醇體積分數(shù)C(%) 3個因素為自變量，每個因素取3個水平，以-1, 0和+1編碼，以甘松浸膏的萃取率為響應(yīng)值進行因素水平設(shè)計(表1).

萃取得率計算公式為：

甘松浸膏的得率(%)=甘松萃取物質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)×100%.

表1 實驗因素水平編碼

1.2.3 同時蒸餾萃取

取 25 g 甘松浸膏放入同時蒸餾萃取裝置一端的 500 mL 圓底燒瓶中，并加入 2 mL 內(nèi)標物萘(質(zhì)量濃度 100 μg/mL)，加入 250 g水后用電熱套加熱回流，裝置的另一端為 100 mL 圓底燒瓶，里面裝有 25 mL 二氯甲烷，在 60 ℃ 水浴中加熱同時蒸餾萃取 2 h.用無水硫酸鈉作為干燥劑對二氯甲烷萃取液進行干燥，置于 4 ℃ 條件下放置，二氯甲烷過濾后將濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約 1 mL，濃縮液用于GC/MS分析備用.

1.2.4 GC/MS分析條件

毛細管柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：240 ℃；載氣：He，1 mL/min；程序升溫：升溫至 50 ℃ 保持 1 min，以 8 ℃/min 升溫至 160 ℃保持 2 min,繼續(xù)以 8℃/min 升溫至 260 ℃ 保持 15 min；進樣量：0.5 μL，分流比：25∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：160 ℃；質(zhì)量范圍35～455 aum.按照方法TCJC-ZY-Ⅳ-014-2012進行檢測，采用NIST14、Wiley275質(zhì)譜譜庫檢索測定分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

2.1.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

按照響應(yīng)面法的Box-Behnken Design(BBD)實驗方案進行實驗，結(jié)果見表2所示.

上述方案的15個實驗點包括12個析因點(1～12)和3個中心點(13～15)，中心點重復(fù)是為了估計整個實驗的純誤差，以甘松浸膏的得率Y作為響應(yīng)面分析的響應(yīng)值.

2.1.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

對表2進行多元回歸擬合后，得到甘松浸膏得率(Y)對超聲功率(A)、萃取時間(B)和乙醇體積分數(shù)(C)的二次多項回歸方程模型為：

Y=-36.851 42+0.123 10×A+0.379 87×B+1.009 33×C+2.250 00E-004×A×B-3.062 50E-004×A×C+1.400 00E-003×B×C-1.004 17E-004×A2-7.826 67E-003×B2-5.729 17E-003× C2

表2 工藝優(yōu)化試驗方案與結(jié)果

續(xù)表2

上述的二次回歸方程方差分析結(jié)果和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3所示.3因素交互作用對甘松得率的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖1～6所示.

表3 回歸方程模型的方差分析結(jié)果

圖1 超聲功率-萃取時間對得率的等值線圖 圖2 超聲功率-萃取時間對得率的響應(yīng)面分析

圖3 超聲功率-乙醇體積分數(shù)對得率的等值線圖 圖4 超聲功率-乙醇體積分數(shù)對得率的響應(yīng)面分析

圖5 萃取時間-乙醇體積分數(shù)對得率的等值線圖 圖6 萃取時間-乙醇體積分數(shù)對得率的響應(yīng)面分析

由表3數(shù)據(jù)和圖1～6可以看出，所得的模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著，說明未知因素對實驗結(jié)果干擾很小.模型的決定系數(shù)R2為 0.994 3(>0.9)，說明該模型能夠分析甘松浸膏得率的響應(yīng)值變化.模型與實際情況擬合較好，適用于分析和預(yù)測超聲波輔助萃取甘松浸膏的實際情況.

由表3可知，一次項A,B和C差異極顯著(P<0.01)，二次項A2、B2和C2均達極顯著水平(P<0.01) ，說明超聲功率、萃取時間和乙醇體積分數(shù)對甘松得率有極顯著的影響.交互項AB、AC達極顯著水平(P<0.01)，BC差異顯著(P<0.05)，說明3因素交互作用對甘松浸膏得率有顯著的影響.

2.1.3 驗證實驗

為深入驗證模型的可靠性，對最優(yōu)方程條件：超聲功率 500.00 W、萃取時間 40.00 min、乙醇體積分數(shù)80.67 %(為便于應(yīng)用，實際超聲波功率 500 W、萃取時間 40 min、乙醇體積分數(shù)80%)進行3次實驗.

由表4可知，經(jīng)過3次實驗驗證，甘松浸膏得率的平均值為42.3%，與優(yōu)化后的回歸方程得到的預(yù)測值43.2%相近，表明該模型可靠，適用于響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波萃取甘松香料浸膏工藝.

表4 驗證實驗

2.2 樣品致香成分檢測結(jié)果和分析

由表5和圖7可知，經(jīng)過超聲波輔助萃取，能夠有效富集甘松中的主要致香成分，經(jīng)GC-MS檢測出甘松香料浸膏有67種成分，其中含量最高的是異戊酸(1 880.351 μg/g)，其次是百秋李醇(932.805 μg/g)，此外含量超過 300 μg/g 的是喇叭烯氧化物-(Ⅱ)(606.377 μg/g)、(+)-γ-古蕓烯(533.779 μg/g)、(-)-斯巴醇(498.844 μg/g)、(+)-香橙烯(319.35 μg/g)、白菖烯(313.182 μg/g).

表5 甘松浸膏致香成分分析

續(xù)表5

圖7 甘松浸膏致香成分總粒子流圖

3 結(jié)果與討論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型可靠，甘松香料浸膏的最佳超聲波萃取工藝為：超聲波功率 500 W、萃取時間 40 min、乙醇體積分數(shù)80%.通過超聲波輔助進行乙醇萃取，能夠有效富集甘松中的主要成分，其中含量最高的是異戊酸，該成分具有濃烈的氣息，經(jīng)過高度稀釋后具有甜潤的果香，可用于食用香料(奶酪、水果香精)、醫(yī)藥制造(生產(chǎn)鎮(zhèn)靜催眠藥物)、煙用香料(存在于白肋煙和香料煙中可改善香煙品質(zhì))；其次是具有木香和膏香氣息的百秋李醇(用于制藥、保健品、煙用香料)和古蕓烯(用于鎮(zhèn)定熏香、香料調(diào)配)；以及具有涼香氣息的(-)-斯巴醇(用于制藥、香料)、藍桉醇(生產(chǎn)香料)、白菖烯(用于制藥、香料).

前人研究主要以非極性溶劑或蒸餾法制備得到揮發(fā)油，以白菖烯、異長葉烯為主要成分，研究其在醫(yī)藥中的作用.而本文以極性溶劑體系制備甘松香料浸膏，獲得以異戊酸、百秋李醇為主要成分的制備方法，所制備得到的甘松浸膏具有獨特的藥草香、木香香韻特征，在食品、日化、香煙中可以賦予特殊的香韻風格，打破甘松主要在醫(yī)藥臨床方面的應(yīng)用，為甘松的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ).