黛力新及其組分對(duì)大鼠體內(nèi)他莫昔芬及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)影響

陳舒 王鵬

他莫昔芬是非甾體類抗雌激素藥，主要用于乳腺癌的輔助治療[1]。他莫昔芬為前體藥物，主要通過細(xì)胞色素P450 2D6酶（CYP 2D6）代謝成為具有生物活性的4-羥基-N-去甲基他莫昔芬（Endoxifen）。研究顯示，抗抑郁藥可不同程度地抑制CYP 2D6酶活性[2]，影響他莫昔芬的體內(nèi)代謝并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，他莫昔芬與抗抑郁藥相互作用已得到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。氟哌噻噸美利曲辛片（商品名：黛力新）為抗抑郁復(fù)方制劑，治療乳腺癌伴焦慮抑郁具有較好效果[4-5]，長期服用他莫昔芬的乳腺癌患者聯(lián)合使用黛力新進(jìn)行抗抑郁治療是臨床普遍采用的治療策略。該研究旨在探討黛力新、氟哌噻噸和美利曲辛對(duì)他莫昔芬在大鼠體內(nèi)代謝的影響，以明確黛力新及其組分對(duì)他莫昔芬體內(nèi)代謝的影響是否一致，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜、Xevo TQD型質(zhì)譜儀（美國Waters公司），WA10005型十萬分之一電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司），XW-80A型渦旋混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Mill-Q A10型超純水系統(tǒng)（默克密理博有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸氟哌噻噸標(biāo)準(zhǔn)品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號(hào)J0612A，純度99.0%），鹽酸美利曲辛標(biāo)準(zhǔn)品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號(hào)RQC226，純度98.40%），他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號(hào)C10388213，純度99%），N-去甲基他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)品（加拿大多倫多研究化學(xué)品公司，批號(hào)6-SKS-119-2，純度98%），地西泮標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，純度95%～105%），磷酸鹽緩

沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司），甲醇、乙腈（色譜級(jí)，德國默克公司），甲酸（色譜級(jí)，德國默克公司），鹽酸（分析級(jí)，北京化工廠公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量為（280±40）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2020-0001。該研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審查。

1.4 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫，見表1），流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.5 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源，采用正離子檢測(cè)方式；毛細(xì)管電壓為2 kv，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，錐孔氣流量為50 L/Hr，脫溶劑氣流量為1,000 L/Hr；采用多離子監(jiān)測(cè)模式，他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和內(nèi)標(biāo)地西泮的MS參數(shù)見表2。

表2 他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和地西泮的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 溶液的制備 （1）他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)品粉末10 mg，甲醇溶解后轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中定容并混勻，即得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩＞芊Q取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。（2）N-去甲基他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取N-去甲基他莫昔芬標(biāo)準(zhǔn)品粉末1 mg，甲醇溶解后轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中定容并混勻，即得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞芊Q取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。（3）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密量取1 mg 地西泮標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL量瓶中，甲醇定容并混勻，即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL地西泮母液。再精密量取5 mL上述母液至另一100 mL量瓶中，加入甲醇稀釋并定容，即得質(zhì)量濃度為500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實(shí)驗(yàn)方案和樣本采集處理 將20只雌性SD大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.3% CMCNa+0.24% DMSO）、氟哌噻噸組（0.21 mg/kg）、美利曲辛組（4.21 mg/kg）和黛力新組（氟哌噻噸0.21 mg/kg+美利曲辛4.21 mg/kg），每組各5只。各組給藥劑量依據(jù)黛力新說明書臨床等效最大給藥劑量折算，藥物配制時(shí)先使用0.5 mL DMSO溶解，再使用0.3% CMC-Na溶液溶解稀釋。各組大鼠在給藥前禁食12 h，但提供自由飲水，相應(yīng)藥物灌胃30 min后，各組均再灌胃他莫昔芬10 mg/kg（0.3% CMCNa溶解）。在給藥結(jié)束后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h，大鼠尾靜脈采集血樣0.3 mL至含肝素的離心管中，以13,000 r/min離心10 min，獲取血漿樣品。取樣品50 μL至1.5 mL離心管中，加入150 μL乙腈沉淀蛋白，加入30 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，充分渦旋2 min后，以13,000 r/min離心5 min，取上清2 μL進(jìn)樣分析。

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證 （1）專屬性：分別取大鼠空白血漿、他莫昔芬組血漿樣品和黛力新處理組大鼠2 h后血漿樣品適量，按照上述樣本方法處理，依據(jù)色譜條件和質(zhì)譜條件分析樣本，得到色譜圖，見圖1。他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.31、1.30、1.31 min。與對(duì)照色譜圖比較，峰型良好，無干擾物，有良好的專屬性。（2）線性范圍及定量下限考察：取空白血漿180 μL，分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μL，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）系列標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品溶液，樣品處理后進(jìn)樣檢測(cè)記錄色譜圖。以系列他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品濃度為橫坐標(biāo)（x），待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得他莫昔芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0310x+0.0097（R2=0.9961），N-去甲基他莫昔芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0293x+0.0015（R2=0.9994）。兩種藥物濃度在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限0.1 ng/mL（信噪比為10∶1）。（3）精密度與準(zhǔn)確度：分別配制低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬），每個(gè)濃度平行制備6份。按照上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，同日內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測(cè)量6次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d進(jìn)樣考察日間精密度。通過實(shí)測(cè)濃度和標(biāo)示濃度的比較來考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的日內(nèi)日間精密度均＜15%，準(zhǔn)確度RE分別為-6.67%～1.43%和-4.18%～4.03%，結(jié)果均符合生物樣本定量分析標(biāo)準(zhǔn)，見表3。（4）基質(zhì)效應(yīng)：取適量空白血漿進(jìn)行樣本處理，處理得到的上清液配制成低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）濃度樣品，各濃度平行6份，取2 μL按照色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積為A1（或B1）。用甲醇分別配制低、中、高濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）純標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接進(jìn)樣檢測(cè)，記峰面積為A2（或B2）。以A1/A2（或B1/B2）分別計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基質(zhì)效應(yīng)均符合要求，見表4。（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照“1.8.2”配制低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）三種濃度的他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬空白血漿溶液，分別考察樣品在室溫、4 ℃、-80 ℃凍融3次和-80 ℃放置30 d后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各濃度樣品在上述四種條件下RSD值均＜15%，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬血漿樣品存貯在上述條件下穩(wěn)定性良好，見表5。

表3 血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的精密度與準(zhǔn)確度（n=6）

圖1 他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及內(nèi)標(biāo)色譜圖

表4 血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

表5 各貯備條件下血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的穩(wěn)定性（n=6）

1.9 數(shù)據(jù)處理方法 應(yīng)用Origin 8軟件分析各采血點(diǎn)的血藥濃度并繪制藥時(shí)曲線。采用DAS 2.0軟件，選擇非房室模型進(jìn)行擬合分析，得到大鼠血漿他莫昔芬及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。使用SPSS 24.0軟件對(duì)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

UPLC-MS/MS法測(cè)定各組大鼠血液中不同時(shí)間點(diǎn)他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的濃度，繪制平均藥時(shí)曲線，見圖2和圖3。依據(jù)血藥濃度求算的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表6和表7。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，氟哌噻噸能顯著降低他莫昔芬的AUC（0-∞）（P＜0.05）和Cmax（P＜0.05），增加他莫昔芬CLz/F（P＜0.05）。美利曲辛對(duì)他莫昔芬在大鼠體內(nèi)過程無明顯影響。黛力新顯著降低他莫昔芬的Cmax（P＜0.05），明顯降低他莫昔芬的AUC和CLz/F，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示氟哌噻噸和黛力新對(duì)他莫昔芬體內(nèi)代謝有不同程度的誘導(dǎo)作用。由圖3、表7可知，與對(duì)照組比較，聯(lián)用氟哌噻噸能顯著降低N-去甲基他莫昔芬的AUC（0-t）（P＜0.05）和Cmax（P＜0.05），增加N-去甲基他莫昔芬CLz/F（P＜0.05）。美利曲辛能顯著增加N去甲基他莫昔芬在大鼠體內(nèi)的清除率CLz/F（P＜0.05），增加表觀分布容積Vz/F（P＜0.05）。黛力新降低N-去甲基他莫昔芬的AUC（0-t）（P＜0.05），增加N-去甲基他莫昔芬的CLz/F，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示氟哌噻噸、美利曲辛和黛力新對(duì)N-去甲基他莫昔芬體內(nèi)代謝均有不同程度的誘導(dǎo)作用。

圖2 四組大鼠中他莫昔芬的藥時(shí)曲線（n=5）

圖3 四組大鼠中N-去甲基他莫昔芬的藥時(shí)曲線（n=5）

表6 4組大鼠血漿中他莫昔芬的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[（±s），n=5]

表6 4組大鼠血漿中他莫昔芬的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[（±s），n=5]

注：與他莫昔芬組比較，*P＜0.05

參. 他莫昔芬. 他莫昔芬+氟哌噻噸組他莫昔芬+美利曲辛組他莫昔芬+黛力新組AUC（0-t）（ug·h/L）1,169.64±256.92 755.36±144.55 1,034.03±266.26 890.24±114.50 AUC（0-∞）（ug·h/L）1,193.00±268.39 779.86±137.79*. 1,073.81±264.15 923.92±143.52 MRT（0-t）（h. 8.18±1.18 7.16±1.03 7.64±0.74 7.78±1.05 MRT（0-∞）（h. 8.55±1.27 7.69±0.94 8.40±1.25 8.56±1.45 t1/2z（h. 3.54±0.43 3.46±0.84 4.48±0.99 4.13±1.43 Tmax（h. 5.20±2.28 6.40±0.89 6.00±1.41 5.20±1.79 CLz/F（L/kg. 0.009±0.002 0.013±0.003*. 0.010±0.002 0.011±0.001 Vz/F[L/（h·kg）] 0.045±0.013 0.064±0.007 0.065±0.030 0.064±0.017 Cmax（ug/L. 137.74±37.28 93.71±21.24*. 123.02±16.62 92.74±12.63*

表7 大鼠血漿中N-去甲基他莫昔芬的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=5）

3 討論

他莫昔芬在體內(nèi)第一步代謝主要經(jīng)過CYP2D6和細(xì)胞色素P450 3A酶（CYP3A）代謝成中間體N-去甲基他莫昔芬，進(jìn)而再由CYP2D6第二步代謝為主要活性代謝產(chǎn)物Endoxifen來發(fā)揮抗腫瘤作用[6-7]。研究顯示，他莫昔芬活性代謝產(chǎn)物血藥濃度低，臨床長期服用4個(gè)月才能達(dá)到較高的穩(wěn)態(tài)血藥濃度[8-9]，所以本實(shí)驗(yàn)方法未能檢測(cè)到Endoxifen血藥濃度與單劑量他莫昔芬給藥后大鼠體內(nèi)Endoxifen血藥濃度偏低有關(guān)，但其中間代謝產(chǎn)物N-去甲基他莫昔芬在某種程度會(huì)直接影響Endoxifen的血藥濃度[10]，并與他莫昔芬表現(xiàn)的不良反應(yīng)有關(guān)[11]。因此，該實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的藥物濃度變化來闡明藥物代謝變化情況，還建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的UPLC-MS/MS定量分析方法，相較于胡東莉等[12]的測(cè)量方法，該方法采用分離度更好的1.7 μm色譜柱，樣品處理采用更為簡便的蛋白沉淀法，具有更好的分離度與峰形，其靈敏度滿足血漿檢測(cè)要求，且已成功用于藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

他莫昔芬第二步代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟哌噻噸、美利曲辛和黛力新均能不同程度地誘導(dǎo)N-去甲基他莫昔芬轉(zhuǎn)化成Endoxifen，說明黛力新的誘導(dǎo)作用是氟哌噻噸和美利曲辛共同作用的結(jié)果。N-去甲基他莫昔芬主要通過CYP2D6酶轉(zhuǎn)化為活性成分Endoxifen，且研究顯示抗抑郁藥會(huì)通過影響CYP2D6酶活性來影響他莫昔芬的體內(nèi)代謝過程[13]，因此筆者猜測(cè)氟哌噻噸和美利曲辛可能通過誘導(dǎo)CYP2D6酶活性來促進(jìn)N-去甲基他莫昔芬的代謝過程，而該誘導(dǎo)作用理論上能減少N-去甲基他莫昔芬的血藥濃度，增加活性代謝產(chǎn)物Endoxifen，前者與藥物的不良反應(yīng)相關(guān)，后者與藥物的療效相關(guān)，可見黛力新對(duì)他莫昔芬具有減毒增效的作用。

他莫昔芬第一步代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟哌噻噸和黛力新對(duì)他莫昔芬的第一步代謝過程有不同程度的誘導(dǎo)作用，但黛力新的誘導(dǎo)作用較氟哌噻噸弱，說明黛力新對(duì)他莫昔芬代謝的誘導(dǎo)作用與其中的氟哌噻噸有關(guān)，且在聯(lián)用美利曲辛后氟哌噻噸的誘導(dǎo)作用有所減弱。初步代謝過程涉及的代謝酶，除CYP2D6外還有CYP3A等其他肝藥酶代謝通道。由此推測(cè)，美利曲辛對(duì)其他肝藥酶通道的抑制作用使得黛力新對(duì)他莫昔芬初步代謝過程的誘導(dǎo)作用弱化。

綜上所述，黛力新對(duì)他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的體內(nèi)代謝過程不僅無抑制作用，還顯示出一定的誘導(dǎo)作用，而且該誘導(dǎo)作用可能與藥物對(duì)肝藥酶的影響有關(guān)，理論上會(huì)提高他莫昔芬的療效和降低不良反應(yīng)，但該觀點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證支持。