肝細(xì)胞生長因子在治療肌腱損傷中的研究進(jìn)展

李家輝 姚立煒 毛海蛟

作者單位：315211寧波大學(xué)（李家輝）315020寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（姚立煒 毛海蛟）

肌腱損傷是一種常見的臨床疾病，隨著社會老齡化程度的加重，其發(fā)病率不斷增長。研究顯示，芬蘭50歲以上人群中肩袖損傷的發(fā)病率從30年前的23%升高至現(xiàn)在的65%[1]；韓國跟腱斷裂的發(fā)病率由2009年的0.21‰增加到2017年的0.26‰[2]；高發(fā)病率的肌腱損傷也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[3]。盡管肌腱損傷的治療水平不斷提升，但肌腱的再生能力弱，其力學(xué)性能往往恢復(fù)不到正常肌腱的一半[4-5]。因此，如何使肌腱在損傷后獲得更好的修復(fù)是目前亟待解決的問題。肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）已被證明可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長、運動和分化[6]，有實驗證實局部注射HGF能夠顯著促進(jìn)肌腱損傷的愈合[7]，其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用也有良好前景[8]。HGF在肌腱修復(fù)過程中具有多種生物學(xué)功能，該文就HGF促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)的相關(guān)機制進(jìn)行綜述。

1 HGF的生物學(xué)性狀

HGF由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞等多種細(xì)胞合成，經(jīng)過多種途徑最后以旁分泌或自分泌的形式促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及DNA合成[9]，在體內(nèi)廣泛分布，肝臟、肺、心臟等均有表達(dá)。HGF的表達(dá)受多種激素和細(xì)胞因子的共同調(diào)節(jié)，包括各種炎癥介質(zhì)和血漿中的細(xì)胞因子。在正常人體中，HGF通常以無活性的單鏈蛋白形式流通，并儲存在細(xì)胞外基質(zhì)中，但是當(dāng)人體受到損害時，HGF則通過誘導(dǎo)尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）激活纖溶反應(yīng)，從而將原HGF裂解為活性HGF[10]。同時，HGF還有多種生物學(xué)作用，比如作為肝再生因子具有促進(jìn)肝細(xì)胞分裂增殖的作用，可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟的肝細(xì)胞以促進(jìn)肝臟再生。此外，HGF也可作為各種干細(xì)胞的有絲分裂原參與各類器官的損傷修復(fù)，研究表明在動物實驗中HGF能夠有效促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的增殖分裂來加速胃黏膜損傷的修復(fù)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的再生來加速腎功能的恢復(fù)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增生來加速受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)，刺激支氣管上皮細(xì)胞的增殖來加速支氣管黏膜損傷的修復(fù)等[11]。此外，HGF還與腫瘤的轉(zhuǎn)移、生長和發(fā)展密切相關(guān)[12]。

2. HGF的促肌腱愈合作用

2.1 HGF通過抗炎作用促進(jìn)肌腱損傷愈合 HGF于1984年被發(fā)現(xiàn)，最初是從血漿和血小板中純化獲得的一種多功能細(xì)胞因子，能刺激多種類型細(xì)胞的分化、增殖、再生、遷移及形態(tài)發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，HGF在多種器官和損傷的修復(fù)中起著重要作用，同時HGF在肌腱損傷修復(fù)中也起著獨特的作用[14]。已有研究表明，炎癥是肌腱干細(xì)胞病理性分化的重要因素之一，而HGF已被證明具有抗炎作用，其可通過抑制由IL-1誘導(dǎo)的COX-1、COX-2和mPGES-1等炎癥基因的表達(dá)，從而抑制巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集，也可通過破壞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)的信號通路來減少炎癥反應(yīng)。YUKSEL等[15]利用小鼠制作跟腱缺損模型，A組用10 ng HGF處理，B組用10 ng HGF+10 ng HGF抗體處理，C組為等劑量0.9%NaCl溶液對照處理，結(jié)果顯示10 ng HGF治療組術(shù)后1、3、12 d的炎癥因子水平明顯低于其他兩組，蛋白免疫印跡顯示COX-1和COX-2蛋白水平也明顯低于其他兩組，證明HGF可以有效抑制炎癥反應(yīng)。ZHANG等[16]也利用大鼠跟腱缺損模型，A組用肌腱干細(xì)胞+HGF處理，B組單用肌腱干細(xì)胞處理，C組用等量0.9%NaCl溶液作為對照，結(jié)果在第1周肌腱干細(xì)胞+HGF實驗組的大鼠M2巨噬細(xì)胞（抗炎）數(shù)量明顯高于其他兩組，而M1巨噬細(xì)胞（促炎）數(shù)量明顯低于其他兩組，體外實驗中IL-6、COX-2、TGF-β1、α-SMA等炎癥基因表達(dá)均明顯下調(diào)，切片顯示第4周和第8周A組肌腱標(biāo)本表現(xiàn)出更完整的膠原纖維排列，均提示HGF通過抑制炎癥表達(dá)促進(jìn)了肌腱損傷的愈合。但是，目前抗炎研究多局限于動物實驗，其具體臨床作用尚需進(jìn)一步探討。

2.2 HGF通過抑制肌腱纖維化促進(jìn)肌腱損傷愈合 肌腱損傷后愈合形成以Ⅲ型膠原為主要成分的纖維瘢痕組織，成纖維細(xì)胞的不定向分化和細(xì)胞外基質(zhì)的過度表達(dá)已被證明是肌腱修復(fù)中纖維化瘢痕形成的主要因素[17]。HGF可通過抑制TGF-β1 的促纖維化作用而促進(jìn)組織再生，阻抑TGF-β1誘導(dǎo)的肌腱成纖維細(xì)胞增殖和α-SMA 蛋白過度表達(dá)，從而抑制α-SMA 蛋白主導(dǎo)的Ⅲ型膠原粘附，最后有效抑制肌腱修復(fù)過程中的肌腱粘附及瘢痕增生[18]。YAO 等[18]的實驗在大鼠肌腱粘附模型中局部注射HGF，結(jié)果顯示實驗組的Ⅲ型膠原蛋白的產(chǎn)生和α-SMA等纖維化基因的表達(dá)顯著低于對照組，體外實驗也發(fā)現(xiàn)HGF顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，證明HGF能夠有效抑制肌腱修復(fù)過程中的纖維化形成。CHEN 等[19]通過實驗發(fā)現(xiàn)，HGF可抑制NF-κB介導(dǎo)的RelA/p65通路表達(dá)，進(jìn)而抑制纖維化，阻抑p65抑制的成纖維細(xì)胞凋亡，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖。還有研究表明，HGF通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路在腎間質(zhì)纖維化過程中的高表達(dá)，從而抑制腎間質(zhì)纖維化[20]。CUI等[21]利用大鼠跟腱缺損模型，A組局部注射100 ng HGF處理，B組注射同量0.9%NaCl溶液作對照，結(jié)果顯示HGF實驗組的α-SMA 蛋白和Ⅲ型膠原表達(dá)明顯低于對照組，組織切片也顯示實驗組較對照組有更規(guī)則緊密的膠原排列，提示HGF可抑制肌腱修復(fù)過程中的瘢痕形成，從而抑制肌腱纖維化修復(fù)。由此可見，HGF抑制肌腱成纖維細(xì)胞增殖的作用已較為明確，但成纖維細(xì)胞也是肌腱修復(fù)過程中不可或缺的一部分，如何平衡二者的動態(tài)關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

2.3 HGF通過調(diào)控肌腱干細(xì)胞分化增殖促進(jìn)肌腱損傷愈合 肌腱干細(xì)胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類肌腱來源的干細(xì)胞[22]，對肌腱損傷的修復(fù)具有獨特優(yōu)勢，而且制備簡便，易于體外培養(yǎng)及傳代等。同時，無論是自體還是同種異體TDSCs都具有較低的免疫原性，避免了自身機體產(chǎn)生排異及炎性反應(yīng)，進(jìn)而避免給機體帶來二次損傷與破壞。實驗也證實，TDSCs能夠在體外特異性表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型膠原及蛋白多糖，并且具有持續(xù)合成Ⅰ型膠原的能力[23]，是TDSCs修復(fù)肌腱的優(yōu)勢所在。另外，TDSCs也具有多向分化的潛能，意味著其不僅可以分化為肌腱細(xì)胞，在一定的病理條件下還能分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等非肌腱細(xì)胞[24]。因此，HGF調(diào)控TDSCs的定向分化作用就顯得尤為關(guān)鍵。ZHANG等[8]利用加入了HGF的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)TDSCs，培養(yǎng)24 h后檢測肌腱細(xì)胞標(biāo)志物Fmod、COLⅠ、COLⅢ和主要的肌腱基因Eyal、Egrl、Scx，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HGF組的肌腱標(biāo)志物表達(dá)顯著高于對照組，表明TDSCs在HGF的誘導(dǎo)下向肌腱細(xì)胞分化的能力明顯增強。HAN等[25]分別使用濃度為0、10、20、40、80 ng/mL的 HGF與TDSCs共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0 ng/mL濃度組的Runχ2和Alp成骨基因表達(dá)較高，表明該組成骨樣分化；但隨著濃度的升高COLⅠ、COLⅢ、TEN-C和 SCx的表達(dá)上調(diào)，顯示TDSCs成腱樣分化，表明HGF的促分化作用與作用時間及濃度相關(guān)。當(dāng)HGF受到抑制時，肌腱纖維排列松散不規(guī)則，纖維間隙明顯增大，COLⅢ、α-SMA 和TGF-β1等纖維化成分生成均顯著增加；當(dāng)HGF表達(dá)增加時，肌腱纖維排列規(guī)則、緊密[16]。上述實驗結(jié)果均可表明，HGF可調(diào)控TDSCs向肌腱細(xì)胞定向分化，但具體調(diào)控機制尚需進(jìn)一步研究。

2.4 HGF通過參與構(gòu)建組織工程材料修復(fù)肌腱損傷 近年來，組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展給肌腱損傷的修復(fù)帶來新的希望。利用組織工程三要素“種子細(xì)胞、生物因子、工程支架”，將種子細(xì)胞種植于生物相容性好的人工材料支架中，利用生物因子將其向肌腱組織定向分化[26]，培養(yǎng)成成熟人工肌腱之后植入患處，從而達(dá)到再生修復(fù)肌腱損傷的目的。近年來，陸續(xù)有實驗證明HGF與其他生物工程材料聯(lián)合應(yīng)用可以取得更好的治療效果。ZHANG等[27]通過構(gòu)建兔前交叉韌帶重建模型，將明膠海綿和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為人工肌腱支架，同時用HGF浸泡處理，實驗證明用HGF處理的實驗組表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能和組織學(xué)評分，在肌腱-骨連接處表現(xiàn)出更完整的軟骨形成和膠原排列。隨后HEXTER等[28]也利用羊制作前交叉韌帶重建模型，A組使用2 mL纖維蛋白（fibrin Sealant，F(xiàn)S）單獨注入指狀肌腱移植物，B組使用HGF+2 mL FS注入指狀肌腱移植物，C組為對照組做單純指狀肌腱移植物置入，結(jié)果顯示術(shù)后12周HGF+FS處理組的肌腱生物力學(xué)明顯優(yōu)于其他兩組，影像學(xué)評分也顯示該組肌腱成熟度明顯高于其他兩組，也證明聯(lián)合應(yīng)用HGF與組織工程材料可以更好地促進(jìn)肌腱損傷后的愈合。由于目前研究多為局限于動物實驗，也缺少多種組織材料聯(lián)合作用的比較研究，其作用機制尚需進(jìn)一步研究。

3 HGF作用于肌腱損傷信號傳導(dǎo)通路的可能機制

作為生長因子的一種，HGF有眾多的信號通路，c-Met作為其特異性受體在肌腱修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，HGF/c-Met信號通路由HGF和其受體c-Met構(gòu)成，兩者結(jié)合后c-Met自身上的兩個酪氨酸殘基磷酸化，繼續(xù)激活受體上的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK），激活的PTK進(jìn)一步激活后續(xù)細(xì)胞內(nèi)不同的信號通路，比如RAS /RAF/MEK/ EKR信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB和STAT3通路等，引起細(xì)胞增殖、分化等一系列生物學(xué)效應(yīng)[29]。HAN等[25]實驗證實，HGF可激活HGF/c-Met進(jìn)而介導(dǎo)其下游AKT和ERK1/2磷酸化，促進(jìn)TDSCs的增殖和遷移能力。HGF還可通過激活肌成纖維細(xì)胞中的單磷酸腺苷激酶（AMPK）通路和粘著斑激酶（FAK）通路抑制TGF-β1的成纖維作用[30-31]。除此之外，HGF還可通過抑制NF-κB介導(dǎo)的非特異性炎癥反應(yīng)促進(jìn)肌腱修復(fù)[32]。不過，以上通路均缺少在肌腱修復(fù)中的臨床實驗證據(jù)，HGF在肌腱修復(fù)中的具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

肌腱損傷作為運動醫(yī)學(xué)的臨床難點之一，逐漸引起社會的重視，但目前臨床上尚無十分有效的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。肌腱損傷的修復(fù)及調(diào)控機制是一個復(fù)雜的過程，不僅是細(xì)胞的增殖分化，還包括炎癥反應(yīng)的調(diào)控和纖維粘連的調(diào)節(jié)。眾多研究表明，HGF是治療肌腱損傷的有效工具，可在抗炎、抗纖維化、調(diào)控細(xì)胞分化等各方面促進(jìn)肌腱損傷的修復(fù)，但因肌腱修復(fù)的機制過程十分復(fù)雜，眾多影響因素交互作用，因此HGF的作用機制還需進(jìn)一步探索，為其臨床應(yīng)用尋求合適的方案。同時，人工肌腱的構(gòu)建已成為治療肌腱損傷的研究熱點，HGF作為生物因子在未來人工肌腱的構(gòu)建中必將占有一席之地，相信未來臨床對肌腱損傷的修復(fù)將會有更行之有效的方法。