半夏外植體消毒方法比較研究

張兆萍，陳 芳，王玉紅，張梅秀，龔永福，王 笑，臧廣鵬，常 瑜，魏玉杰*，蘇毓杰

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質(zhì)創(chuàng)新與安全利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅武威 733006)

半夏[(Thunb.)Breitenb]又名三興草、地星、三葉半夏等，為天南星科半夏屬多年生草本植物，干燥塊莖具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效。除內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏外，全國(guó)其他各地廣布野生半夏，其已有2 000多年的臨床藥用歷史，是30種應(yīng)用最廣泛的中藥之一。傳統(tǒng)中藥以采挖野生半夏為主，但由于半夏資源超量開發(fā)與利用，野生半夏資源已日漸枯竭。為滿足藥用需求，半夏人工栽培的面積不斷擴(kuò)大，但在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，栽培半夏多采用小塊莖、珠芽等方法進(jìn)行繁殖，不僅存在種苗短缺、繁殖系數(shù)較低的問題，而且多代無性繁殖易造成種質(zhì)退化、病毒感染嚴(yán)重，引起葉片斑駁、變形、皺縮、卷曲等癥狀，使植株生長(zhǎng)不良，減產(chǎn)可達(dá)60%，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和藥用品質(zhì)，同時(shí)，由于各地間相互引種，造成種質(zhì)資源混亂，藥材質(zhì)量難以保證。采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以有效地保存半夏種質(zhì)資源，而且能進(jìn)行優(yōu)良品種的快速繁殖，滿足生產(chǎn)上的需要，從而有效保障半夏品質(zhì)。

半夏組織培養(yǎng)開始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過眾多科學(xué)工作者的不斷探索研究，目前已逐漸形成一套完整的組織培養(yǎng)體系，但主要集中于脫毒快繁、遺傳轉(zhuǎn)化體系建立和生物堿代謝方面，而對(duì)外植體的選擇相關(guān)研究較少。外植體本身所特有的因子對(duì)培養(yǎng)物的器官分化和形態(tài)建成有決定性的影響，因此，開展半夏組培過程中外植體種類及有效消毒方式的篩選對(duì)半夏胚性愈傷組織誘導(dǎo)十分必要。該研究分別以野生半夏和栽培半夏的珠芽和塊莖2個(gè)典型取材部位為外植體，研究不同種類消毒劑組合對(duì)珠芽和塊莖污染率、成活率的影響，分析比較野生與栽培半夏組織培養(yǎng)的差異，篩選出半夏適宜組織培養(yǎng)的外植體類型及最佳消毒方式誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)，以期為半夏組織培養(yǎng)快繁體系的建立及分子育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

供試材料野生半夏塊莖、株芽來自隴南市西和縣，栽培半夏塊莖、株芽來自天水市清水縣。MS培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

外植體前處理。選擇整齊、大小一致的野生半夏、栽培半夏塊莖、珠芽，流水沖洗干凈表層灰塵、泥土等物質(zhì)，用手輕輕剝?nèi)シN球、珠芽表層多余雜質(zhì)；放入干凈廣口瓶?jī)?nèi)，用自來水沖洗數(shù)遍；加入少許洗潔精，輕搖沖洗30 min；反復(fù)用清水沖洗干凈洗潔精，直至無泡沫；用超純水沖洗5～6遍，放入紫外殺菌后的超凈臺(tái)，以備下一步工作。

外植體消毒處理及接種。外植體消毒處理見表1。每次消毒劑處理期間均需不停搖晃消毒瓶，保證外植體充分接觸消毒劑，取出后用無菌水清洗5～6遍備用。分別將種球、珠芽放置于干凈濾紙上，每個(gè)消毒處理接種60瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，培養(yǎng)基為不添加激素的MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。外植體接種后，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間 12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。

表1 不同消毒方式及處理時(shí)間Table 1 Different disinfection methods and treatment time

采用以下公式計(jì)算污染率和成活率。

污染率=(污染材料數(shù)/總接種材料數(shù))×100%

(1)

成活率=(成活材料數(shù)/總接種材料數(shù))×100%

(2)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel整理，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析及顯著性分析。用隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)12個(gè)處理污染率和成活率。隸屬函數(shù)值計(jì)算公式如下：

式中，表示第個(gè)指標(biāo)值，為第個(gè)指標(biāo)的最小值，為第個(gè)指標(biāo)的最大值，若該指標(biāo)與產(chǎn)量呈相反關(guān)系則為負(fù)向指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

塊莖消毒比較。從圖1可以看出，NaClO和HgCl不同消毒濃度和處理時(shí)間對(duì)野生、栽培半夏塊莖污染率和成活率影響很大。X～X處理為NaClO消毒，同一濃度隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，野生和栽培半夏塊莖均表現(xiàn)為污染率降低，成活率升高，但變化幅度較小，無顯著差異；相同處理時(shí)間(X、X、X，X、X、X，X、X、X)，隨著NaClO濃度升高，半夏塊莖污染率降低，說明NaClO消毒濃度比其作用時(shí)間對(duì)半夏外植體污染率的影響更大。X～X處理為HgCl消毒，隨著0.1% HgCl處理時(shí)間延長(zhǎng)，野生、栽培半夏塊莖污染率均表現(xiàn)為XX>X，栽培半夏塊莖成活率為X>X>X。

X～X處理半夏塊莖污染率在73.33%～95.56%，成活率在1.67%～22.22%，X～X處理半夏塊莖污染率在10.56%～22.22%，成活率在64.44%～73.89%，可見采用HgCl進(jìn)行半夏塊莖消毒污染率顯著低于NaClO，成活率顯著高于NaClO。綜合考慮污染率及成活率，可知適合半夏塊莖消毒的最佳處理為X。比較野生半夏塊莖和栽培半夏塊莖污染率和成活率可知，相同消毒處理下，野生半夏塊莖與栽培半夏塊莖污染率多數(shù)表現(xiàn)為野生半夏塊莖污染率低于栽培半夏塊莖污染率，野生半夏塊莖成活率高于栽培半夏塊莖成活率。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)圖1 不同消毒處理下野生與栽培半夏塊莖污染率、成活率的比較Fig.1 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata tubers under different disinfection treatments

珠芽消毒比較。從圖2可以看出，采用HgCl對(duì)半夏株芽進(jìn)行消毒處理(X～X)時(shí)，污染率顯著低于NaClO處理(X～X)，成活率顯著升高。不同NaClO處理時(shí)間及濃度對(duì)半夏株芽污染率影響較小，而株芽污染率為71.67%～91.11%，成活率均較低，為5.00%～23.33%，而采用HgCl處理時(shí)，株芽污染率降至7.22%～13.33%，成活率達(dá)66.11%～73.89%，故采用HgCl進(jìn)行半夏株芽消毒效果較好。比較不同0.1% HgCl處理時(shí)間，野生、栽培半夏株芽污染率為XX>X，栽培半夏株芽成活率為X=X>X，綜合考慮污染率及成活率，可以得出適合半夏株芽消毒的最佳處理為X。

由圖2可知，野生半夏株芽與栽培半夏株芽污染率存在差異，多數(shù)表現(xiàn)為野生半夏株芽污染率低于栽培半夏株芽污染率，野生半夏株芽成活率高于栽培半夏株芽成活率。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)圖2 不同消毒處理下野生與栽培半夏株芽污染率、成活率的比較Fig.2 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata buds under different disinfection treatments

相同消毒處理下野生半夏不同外植體間消毒比較。由表2可知，同一處理野生半夏塊莖與株芽間污染率、成活率存在差異，除X處理外，其余處理均為株芽污染率低于塊莖污染率；除X、X、X外，其余處理株芽成活率均高于塊莖成活率，污染率變化趨勢(shì)與成活率呈相反趨勢(shì)。

表2 相同消毒處理下野生半夏塊莖與株芽間污染率、成活率的比較Table 2 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and plant bud of wild Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

相同消毒處理下栽培半夏不同外植體間消毒比較。由表3可知，同一處理栽培半夏塊莖與株芽間污染率、成活率存在差異，與野生半夏塊莖、株芽變化規(guī)律一致，除X處理外，其余處理均為株芽污染率低于塊莖污染率；除X、X外，其余處理株芽成活率均高于塊莖成活率，污染率變化趨勢(shì)與成活率呈相反趨勢(shì)。

隸屬函數(shù)法可以將定性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化為定量評(píng)價(jià)，還能消除單一指標(biāo)的片面性，應(yīng)用非常廣泛。利用隸屬函數(shù)法對(duì)12個(gè)處理污染率和成活率進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，值越大，處理的外植體生長(zhǎng)越好(表4)。X處理，野生塊莖、栽培塊莖、野生珠芽、栽培珠芽隸屬函數(shù)平均值排名分別為3、9、1、4，均優(yōu)于其他處理，表明X處理是適合半夏外植體消毒的最佳處理。

表3 相同消毒處理下栽培半夏塊莖與株芽間污染率、成活率的比較Table 3 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and bud of cultivated Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

3 討論與結(jié)論

根據(jù)植物細(xì)胞的全能性，在植物組織培養(yǎng)過程中任何組織均可作為外植體，但不同部位組織脫分化和再分化難易程度不同，以及滅菌難度差異較大，所以在組織培養(yǎng)時(shí)外植體的選擇十分重要。在半夏組織培養(yǎng)過程中，通常選用葉片、葉柄、塊莖、莖尖、根和珠芽作為外植體。

該研究結(jié)果表明，相同的消毒處理下，野生半夏塊莖、株芽污染率低于栽培半夏塊莖、株芽污染率，且同種類型半夏品種株芽的污染率較塊莖的污染率低。這可能是因?yàn)橐吧胂纳L(zhǎng)環(huán)境單一，受外在條件影響小，而栽培半夏受人為施肥、打藥等管理影響，生長(zhǎng)環(huán)境相對(duì)復(fù)雜。同理，塊莖染菌率高，較難消毒也可能是因?yàn)閴K莖生長(zhǎng)于地下，環(huán)境復(fù)雜，相對(duì)株芽接觸細(xì)菌及霉菌較多，不易清除，這與吳能表等的研究結(jié)果一致。

表4 隸屬函數(shù)值及綜合排名Table 4 Membership function value and comprehensive ranking

該研究結(jié)果還表明，分別以NaClO和HgCl作為消毒劑，野生、栽培半夏塊莖、株芽的污染率、成活率均具有明顯差異。且NaClO消毒濃度比NaClO作用時(shí)間對(duì)半夏外植體污染率的影響大。隨著0.1% HgCl處理時(shí)間延長(zhǎng)，外植體的染菌率逐漸減少，但成活率也有一定降低。HgCl和NaClO是植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑，其中HgCl消毒效果極佳，但HgCl為劇毒物質(zhì)，對(duì)植物細(xì)胞傷害大。鑒于半夏的生長(zhǎng)習(xí)性，組織培養(yǎng)時(shí)外植體細(xì)菌比較頑固，采用HgCl進(jìn)行消毒效果佳，但如果消毒劑浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，則容易導(dǎo)致植物細(xì)胞受損嚴(yán)重而影響外植體的存活率，可見消毒時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)外植體傷害越大，這與金青等的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)最終篩選出采用X處理(75%乙醇50 s、0.1%HgCl10 min)時(shí)，半夏塊莖、株芽消毒效果最好，此時(shí)污染率低，而成活率較好。