基于PI3K/AKT信號通路的大黃牡丹湯對急性胰腺炎大鼠肺組織細胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響

楊丹，孫銀鳳，白敏，宋冰，張延英，汪永鋒，康萬榮

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省實驗動物行業(yè)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）由多種原因引起，發(fā)病機制復(fù)雜。近年來，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，常出現(xiàn)炎癥瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，其中以急性肺損傷最為常見，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其病理機制主要是炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失調(diào)，而細胞凋亡在二者之間起到調(diào)節(jié)作用。PI3K/AKT信號通路與細胞凋亡密切相關(guān)，是AP引發(fā)肺損傷的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其通過調(diào)節(jié)肺泡上皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞活性，介導(dǎo)肺損傷發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃牡丹湯可下調(diào)AP模型大鼠血清炎癥因子，改善胰腺組織病理變化，但對細胞凋亡的調(diào)控機制并不明確。因此，本研究從PI3K/AKT信號通路觀察大黃牡丹湯對AP模型大鼠肺組織細胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，明確其在AP肺損傷早期病理反應(yīng)中的作用機制，為臨床治療AP肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

2 月齡SPF 級雄性Wistar 大鼠96 只，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障實驗室，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～45%，12 h晝夜交替，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0009。動物操作與處理遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理原則。

1.2 藥物及制備

大黃牡丹湯（大黃12 g，牡丹皮9 g，芒硝9 g，桃仁12 g，冬瓜子30 g），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，并由該院煎藥室制備成原藥材濃度為1 g/mL煎劑。醋酸奧曲肽注射液，國藥一心制藥有限公司，批號171003，0.5 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml102828、ml037361、ml002859）；牛磺膽酸鈉（北京Solarbio 公司，批號1111J051）；RT-PCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號H4104620）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司，批號0000366052）；PI3K抗體（英國Abcam公司，批號GR3192684-9）；p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗體（美國Immunoway公司，批號分別為B0601、B4101、B5501、B8501、B1501）；HE 染色劑（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1005）；二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號BST3C23C54）。微量注射泵（型號SN-50T6，深圳圣諾醫(yī)療設(shè)備有限公司）；高通量組織研磨器（型號SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速低溫離心機（型號5910R，德國艾本德股份公司）；電子天平（型號DF110，江蘇常熟衡器工業(yè)有限公司）；超微量熒光分光光度計（型號DS-11，美國DeNovix 公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（型號Benchmark Plus，美國Bio-Rad 公司）；實時定量PCR 儀（型號CFX96，美國Bio-Rad 公司）；反轉(zhuǎn)錄儀（型號S1000，美國Bio-Rad公司）；電泳槽（型號JY-SPAT，美國Bio-Rad 公司）；電泳儀（型號Power PacUniversal Power Supply，美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（型號Chemi DOC XRS＋，美國Bio-Rad公司）；組織包埋機（型號YB-6LF，湖北亞光公司）；石蠟切片機（型號RM2235，德國Leica 公司）；光學(xué)顯微鏡（型號BX53F，日本Olympus 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（型號DW-86l626，青島海爾公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

96只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機取16只作為空白組，其余80只采用胰膽管逆行注射?；悄懰徕c制備AP大鼠模型。造模前12 h大鼠禁食不禁水，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于固定板上，充分暴露腹部。備皮消毒后，沿劍突下切開，將十二指腸從腹腔取出，充分暴露胰膽管，將新鮮配制的5%?；悄懰徕c溶液注入胰膽管，體積1 mL/kg，注射完成后，復(fù)納十二指腸，逐層縫合關(guān)腹。將大鼠統(tǒng)一體位放回鼠籠，保溫，禁食不禁水，密切觀察其生命體征。造模后按隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組、奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中、低劑量組，每組16只。

2.2 干預(yù)

參考《中藥藥理實驗方法學(xué)》換算給藥劑量，奧曲肽組予0.01 mg/kg 奧曲肽背部皮下注射（相當(dāng)于60 kg成人每日用量6倍），注射體積1 mL/kg，大黃牡丹湯高、中、低劑量組分別予14、7、3.5 g/kg大黃牡丹湯煎劑灌胃（相當(dāng)于60 kg成人每日用量的12、6、3倍），空白組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，分別于造模前1 h及造模后12、24 h各給藥1次，共給藥3次。

2.3 一般狀態(tài)觀察

每日觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動度、是否出現(xiàn)扭體反應(yīng)、大便次數(shù)及便質(zhì)改變等情況。

2.4 取材

末次給藥1 h后，每組隨機選取6只大鼠5%水合氯醛腹腔注射（0.5 mL/100 g）麻醉，心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，分離血清，用于生化指標檢測。頸椎脫臼法處死大鼠，取出胰腺和肺臟，取右肺組織及部分胰腺組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。取左肺組織迅速放入-80 ℃冰箱保存，用于ELISA、RT-PCR和Western blot檢測。

2.5 生化指標檢測

取大鼠血清，采用生化分析儀檢測血清淀粉酶（AMS）、C反應(yīng)蛋白（CRP）含量。

2.6 病理學(xué)檢測

取4%多聚甲醛溶液固定的胰腺和肺組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，恒溫箱烘烤過夜，光鏡下觀察并拍照。

2.7 ELISA檢測

取左肺組織，加入組織裂解液，經(jīng)組織研磨器研磨制備勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2.8 RT-PCR檢測

采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，以β-actin為內(nèi)參，2法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot檢測

取0.1 g肺組織剪碎，加入600 μL組織裂解液（含2%PMSF），組織研磨器研磨，13 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加PI3K一抗（1∶2 000）、p-AKT一抗（1∶500）、Caspase-3一抗（1∶1 000）、一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，Quantity One圖像分析軟件進行掃描，Image J軟件計算蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 大黃牡丹湯對模型大鼠一般狀況的影響

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，二便正常，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠瞇眼倦臥，抖動，皮毛雜亂無光澤，二便減少；各給藥組大鼠倦臥嗜睡、皮毛雜亂、活動度減少等狀況有所改善，大黃牡丹湯高、中、低劑量組大鼠有不同程度腹瀉，其中大黃牡丹湯高劑量組最為明顯。

4.2 大黃牡丹湯對模型大鼠胰腺和肺組織病理變化的影響

空白組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠胰腺組織可見葉間隙增寬、腺泡分離，小葉結(jié)構(gòu)欠完整，腺泡細胞充血，有炎性細胞浸潤及壞死；各給藥組大鼠胰腺組織病理變化有不同程度改善，細胞壞死、水腫及充血減少，其中大黃牡丹湯高劑量組效果最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)（HE染色，×200）

空白組大鼠肺組織無明顯病理改變；模型組大鼠肺間質(zhì)擴大，毛細血管充血，肺泡腔出血，水腫范圍增加，炎癥細胞浸潤明顯；各給藥組大鼠肺組織病理變化有不同程度改善，間質(zhì)水腫和炎性細胞浸潤明顯減少，其中大黃牡丹湯高劑量組效果最為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 大黃牡丹湯對模型大鼠血清淀粉酶、C反應(yīng)蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清AMS、CRP含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠血清AMS、CRP含量顯著減少（＜0.01），大黃牡丹湯低劑量組大鼠血清CRP含量顯著減少（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清AMS、CRP含量比較（）

4.4 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低（＜0.01，＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（，pg/mL）

4.5 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA 表達顯著升高，Bcl-2 mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，奧曲肽組和大黃牡丹湯高、中劑量組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA表達顯著降低，奧曲肽組和大黃牡丹湯高劑量組大鼠肺組織Bcl-2 mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肺組織PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達比較（）

4.6 大黃牡丹湯對模型大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（）

圖3 各組大鼠肺組織PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡

5 討論

AP屬中醫(yī)學(xué)“脾心痛”“腹痛”“脅痛”等范疇。中醫(yī)認為，腑氣不通是引起腹痛的主要病因之一，而肺與大腸相表里，腑氣不通會影響肺的宣發(fā)肅降，進而出現(xiàn)咳嗽、氣喘、胸悶等肺部表現(xiàn)。大黃牡丹湯載于《金匱要略》，由大黃、桃仁、牡丹皮、芒硝、冬瓜子組成。方中大黃清熱解毒、瀉下逐瘀，芒硝清熱解毒、瀉下通便，桃仁、牡丹皮涼血活血兼化瘀，冬瓜子利濕排膿散結(jié)。全方具有瀉熱破瘀、散結(jié)消腫功效，用于治療熱毒結(jié)于腸、氣滯血瘀所致腹痛。臨床研究表明，大黃牡丹湯治療AP患者較西藥常規(guī)治療具有用藥安全、療效顯著、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢。實驗研究表明，大黃牡丹湯可有效調(diào)降低AP模型大鼠炎癥因子水平，促進胰腺組織修復(fù)。

肺損傷是AP最常見的早期并發(fā)癥，全身炎癥反應(yīng)是其主要發(fā)病原因。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃牡丹湯減輕炎癥反應(yīng)與調(diào)控Toll樣受體4表達有關(guān)。Toll樣受體4與內(nèi)毒素、脂多糖結(jié)合后可激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6 等釋放，參與炎癥反應(yīng)。IL-6可促進中性粒細胞活化和聚集，誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，引起肺水腫；TNF-α可以刺激細胞分泌IL-1β等炎癥介質(zhì)，進一步加重炎癥反應(yīng)；IL-1β可增加細胞對TNF-α 的敏感性，并刺激細胞釋放TNF-α等細胞因子。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較空白組顯著增加，提示AP從局部炎癥反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槿硌装Y反應(yīng)，進而損害其他臟器，這可能是導(dǎo)致AP患者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征的主要原因之一。各給藥組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較模型組減少，胰腺組織和肺組織病理損傷有不同改善，表明大黃牡丹湯能有效減少模型大鼠炎癥反應(yīng)，減輕胰腺、肺組織病理損傷。

細胞凋亡在AP發(fā)病過程中扮演重要角色，主要發(fā)生于胰腺腺泡細胞和胰外器官，如肺臟、肝臟等。凋亡是細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)生的程序性死亡，大黃牡丹湯能使酶原物質(zhì)從腺泡內(nèi)轉(zhuǎn)移到腺泡外，促進胰腺腺泡細胞凋亡，減輕AP所致炎癥反應(yīng)。目前肺損傷的細胞凋亡機制存在2種不同觀點：一種認為促進中性粒細胞凋亡會降低肺損傷嚴重程度，即減輕炎癥反應(yīng)；另一種認為減少肺組織毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞凋亡可減輕肺損傷。激活PI3K/AKT信號通路可啟動其下游抑凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Bax，Caspases家族主要參與炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)凋亡，激活Caspase-3可提高細胞凋亡率，并導(dǎo)致Caspases家族其他蛋白酶級聯(lián)釋放。研究發(fā)現(xiàn)，肺損傷大鼠PI3K/AKT信號通路高表達，中藥干預(yù)可通過提高Bcl-2表達、降低Caspase-3和Bax表達，減少細胞凋亡，進而減輕肺損傷。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表達顯著升高，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著降低，AKT mRNA和p-AKT蛋白表達顯著升高，提示PI3K/AKT信號通路與AP肺損傷關(guān)系密切。各給藥組大鼠肺組織PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表達不同程度降低，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達不同程度升高，AKT mRNA和p-AKT蛋白表達不同程度降低，表明抑制PI3K/AKT信號通路能減少肺組織血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而減輕急性肺損傷病理變化。大黃牡丹湯主要成分大黃素、丹皮酚可抑制PI3K/AKT 信號通路，減少細胞凋亡，這可能是大黃牡丹湯治療AP肺損傷的機制之一。

綜上所述，大黃牡丹湯對AP模型大鼠肺組織損傷具有保護作用，可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，減少肺組織細胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實驗可為大黃牡丹湯治療AP 繼發(fā)肺損傷提供實驗依據(jù)和臨床思路。