基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討薏苡仁-蒼術(shù)“異病同治”類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制

莫美玲，羅嗣雄，劉永芳，楊靈梅，黃秉慧，甘麗賢，陳延強(qiáng)

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530004；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性全身性自身免疫性疾病，通常表現(xiàn)為局部關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹等，其病理改變主要是慢性滑膜炎、滑膜增生、骨侵蝕等。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是一種因長(zhǎng)期高尿酸血癥導(dǎo)致的單鈉尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)腔等所致的全身性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為局部紅、腫、熱、痛等，主要病理改變有滑膜炎等。

RA及GA均屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，且病因病機(jī)多有相似?！端貑枴け哉撈贰氨圆?，五臟虧虛為之大因”，《濟(jì)生方·痹》“非獨(dú)責(zé)之于風(fēng)寒濕，體虛相合，痹證乃生”，強(qiáng)調(diào)了臟腑在痹證發(fā)病中的重要作用?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈费裕骸爸T濕腫滿，皆屬于脾。”《脾胃論》曰：“脾病，體重即痛，為痛痹，為寒痹，為諸濕痹?！瘪R武開教授提出RA的發(fā)病基礎(chǔ)是脾虛濕阻經(jīng)脈，認(rèn)為脾虛生內(nèi)濕，加之外濕困脾，內(nèi)外相合，日久入絡(luò)，致四肢關(guān)節(jié)疼痛，纏綿難愈。李濟(jì)仁教授認(rèn)為，GA屬內(nèi)外因雜合而致，“濁濕內(nèi)蘊(yùn)、經(jīng)絡(luò)痹阻”是其病機(jī)關(guān)鍵。由此可見，二者病變部位均與脾臟關(guān)系密切，病機(jī)均有脾虛濕阻經(jīng)絡(luò)，可能為中醫(yī)“異病同治”的基礎(chǔ)。

薏苡仁和蒼術(shù)均為臨床常用健脾除濕藥。薏苡仁甘、淡，微寒，有健脾補(bǔ)中、利水消腫、滲濕除痹等功效，亦能舒筋脈，緩和拘攣，常用于濕痹而筋脈攣急的疼痛；蒼術(shù)辛、苦，溫，有燥濕健脾、祛風(fēng)濕等功效，常用于濕阻中焦、風(fēng)寒濕痹、腳膝腫痛等。如《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》蒼術(shù)薏苡湯即以二者為君，具有祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)功效。薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)共奏燥濕健脾之功，治痹證濕勝者尤宜。郭會(huì)卿教授治療濕痹時(shí)擅聯(lián)合使用大劑量生、炒薏苡仁以健脾祛濕，常加蒼術(shù)等增強(qiáng)健脾祛濕之功，效果顯著。周芳伊分析健脾祛濕法治療GA相關(guān)用藥，其中薏苡仁、蒼術(shù)使用頻率分別居第1、2位。王欣妍等基于數(shù)據(jù)挖掘分析近10年RA活動(dòng)期用藥規(guī)律，頻次排名前5位中藥包括薏苡仁、蒼術(shù)。薏苡仁及蒼術(shù)對(duì)脾虛濕阻型RA、GA均有良好療效，體現(xiàn)了“異病同治”理念。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)“異病同治”RA及GA的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，為其臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 薏苡仁-蒼術(shù)活性成分及靶點(diǎn)篩選

分別以“薏苡仁”“蒼術(shù)”為關(guān)鍵詞檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件篩選藥物活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范并轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.2 疾病靶點(diǎn)收集

分別以“rheumatoid arthritis”及“gouty arthritis”“gout”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）數(shù)據(jù)庫(kù)收集RA和GA的疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過Venny2.1軟件分析RA、GA疾病靶點(diǎn)與薏苡仁-蒼術(shù)藥物靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用該軟件Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)節(jié)點(diǎn)度值（degree）判斷薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA的核心成分。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將藥物與疾病交集靶點(diǎn)上傳至STRING11.0（https://string-db.org/），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“medium confidence”（≥0.400），其余參數(shù)為默認(rèn)值，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的度值找出核心基因，度值越大代表其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

運(yùn)用R4.0.5軟件先將基因簡(jiǎn)稱（Symbol）轉(zhuǎn)化為基因ID（EntrezID），然后運(yùn)用R 軟件的colorspace、stringi、ggplot2 包及Bioconductor 平臺(tái) 的DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview程序包進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG 通路富集分析，并繪制信號(hào)通路圖。

1.6 中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)活性成分、KEGG富集分析前20條通路及對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，借助Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 薏苡仁-蒼術(shù)的活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP檢索并篩選后共獲得薏苡仁和蒼術(shù)各9種活性成分，刪除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分，最終獲得10種活性成分，分別為薏苡仁6種、蒼術(shù)4種，見表1。薏苡仁、蒼術(shù)活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別為42、65個(gè)，合并后刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到薏苡仁-蒼術(shù)靶點(diǎn)70個(gè)。

表1 薏苡仁-蒼術(shù)活性成分

2.2 疾病靶點(diǎn)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到RA、GA相關(guān)靶點(diǎn)4 734、1 565個(gè)，通過OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到RA、GA相關(guān)靶點(diǎn)42、10個(gè)，合并后去重，分別獲得RA、GA靶點(diǎn)4 763、1 572個(gè)。

2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到24個(gè)共同靶點(diǎn)。利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含82個(gè)節(jié)點(diǎn)和117條邊，節(jié)點(diǎn)度值越大，表明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，度值前3位的活性成分分別為Wogonin（漢黃芩素）、Stigmasterol（豆甾醇）、3β-acetoxyatractylone（3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮），其度值分別為44、29、21，這些成分可能是薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA的核心成分。

圖1 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將24個(gè)交集靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共有24個(gè)節(jié)點(diǎn)和136條邊。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出度值大于中位數(shù)的基因（見圖3），分別為AKT1、IL6、TNF、CXCL8、PTGS2、TP53、MAPK14、JUN、KDR、NOS2、PPARG、HSP90AA1，可能是薏苡仁-蒼術(shù)“異病同治”RA及GA的核心基因。

圖2 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA核心基因

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

24個(gè)交集基因GO功能富集分析結(jié)果顯示：生物過程（BP）有1 238條，主要與急性炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)及對(duì)脂多糖的反應(yīng)等相關(guān)，見圖4A；細(xì)胞組分（CC）有9條，主要包括膜筏、質(zhì)膜微區(qū)、膜區(qū)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、外膜等，見圖4B；分子功能（MF）有38條，涉及蛋白磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性等，見圖4C。KEGG通路富集分析得到123條通路，主要有Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）及NF-κB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）等，見圖4D。選取圖中與RA及GA相關(guān)性較大的Toll樣受體信號(hào)通路繪制通路圖，見圖5。

圖4 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA靶點(diǎn)富集分析

圖5 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA的Toll樣受體信號(hào)通路

2.6 中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

將薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)活性成分、KEGG富集分析前20條通路及對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，繪制中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)反映出薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)治療RA及GA通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路調(diào)控而發(fā)揮“異病同治”作用。

圖6 薏苡仁-蒼術(shù)治療RA及GA的中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

“異病同治”是指不同疾病在發(fā)展過程中出現(xiàn)相同病機(jī)時(shí)可采用相同的治法。RA及GA西醫(yī)病因雖不同，但二者均有炎癥反應(yīng)，臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔積液等，均為濕邪作祟，病機(jī)以脾虛為本。薏苡仁-蒼術(shù)藥對(duì)有燥濕健脾之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁具有抗炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)水液代謝、抗氧化、抗腫瘤等作用，蒼術(shù)具有抗炎鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)免疫、利尿、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖等作用。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，共篩選出薏苡仁-蒼術(shù)10種有效活性成分，70個(gè)作用靶點(diǎn)，24個(gè)藥物與RA及GA交集靶點(diǎn)。薏苡仁-蒼術(shù)的關(guān)鍵活性成分為漢黃芩素、豆甾醇、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮等。研究表明，漢黃芩素有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等作用。Huynh等發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素對(duì)環(huán)氧化酶-2和前列腺素E2（PGE2）的抑制作用是急性炎癥的主要分子機(jī)制，漢黃芩素還可能通過抑制Th1細(xì)胞因子和增加Th2細(xì)胞因子，從而減少炎癥。Huang等研究表明，漢黃芩素通過抑制p38/MAPK和NF-κB/p65的磷酸化調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性，并誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激表達(dá)。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。Gabay等研究顯示，豆甾醇可抑制多種炎癥介質(zhì)及基質(zhì)降解，且至少部分通過抑制NF-κB 通路來阻礙與軟骨降解有關(guān)的MMPs的表達(dá)，同時(shí)對(duì)促炎介質(zhì)PGE2產(chǎn)生抑制作用。蒼術(shù)酮具有抗炎、抗病毒等作用，Kim等發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮可減弱caspase-1/NF-κB/MAPKs通路的激活，減少炎癥因子產(chǎn)生。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析提示，薏苡仁-蒼術(shù)干預(yù)RA和GA的過程主要涉及AKT1、IL6、TNF、CXCL8、PTGS2、TP53、MAPK14、JUN、KDR、NOS2、PPARG、HSP90AA1等靶基因。IL6能促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的急性期反應(yīng)，被認(rèn)為是炎癥、免疫反應(yīng)的介質(zhì)。Ahsan等通過關(guān)節(jié)炎大鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，使用藥物抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2等促炎因子表達(dá)，可有效改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，使大鼠爪腫脹顯著下降，降低ESR及CRP等指標(biāo)，減緩骨侵蝕等。Dai等研究尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)的急性GA大鼠模型發(fā)現(xiàn)，Tregs/Th17細(xì)胞失衡可能參與了急性GA發(fā)病，而IL-6是決定Treg/Th17平衡的關(guān)鍵因素，提示抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等基因是治療急性GA發(fā)作的新策略。研究表明，GATA1通過誘導(dǎo)NOS2轉(zhuǎn)錄參與了RA的發(fā)展和惡化，導(dǎo)致破壞軟骨等。HSP90AA1可間接阻滯NF-κB信號(hào)通路激活，減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，HSP90AA1靶向藥物可用于治療RA，可減少滑膜炎癥和防止軟骨破壞。研究表明，AKT1可參與炎癥、免疫代謝和細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號(hào)通路，在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠中，circRNA_09505可以充當(dāng)miR-6089海綿并通過miR-6089/AKT1/NF-κB軸調(diào)節(jié)炎癥，顯著緩解小鼠關(guān)節(jié)炎和體內(nèi)炎癥。MAPK家族參與炎癥反應(yīng)、凋亡、增殖和分化等多種細(xì)胞功能，其參與RA 發(fā)生發(fā)展已得到廣泛確認(rèn)。研究亦顯示，MAPKs信號(hào)通路介導(dǎo)了GA發(fā)生與發(fā)展。p53蛋白由TP5基因編碼，p53上調(diào)可能促進(jìn)疾病進(jìn)展中的軟骨細(xì)胞凋亡，p53抑癌基因和其他關(guān)鍵調(diào)控基因突變的發(fā)展可能有助于將炎癥轉(zhuǎn)化為RA和其他炎癥性疾病的慢性疾病，在RA患者的滑膜中觀察到p53顯著過度表達(dá)。趨化因子是趨化性促炎細(xì)胞因子，可將白細(xì)胞募集到炎癥部位，在腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、組織硬化和自身免疫中也具有重要作用。CXCL8是CXC趨化因子家族的成員，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明CXCL8是RA疾病的重要危險(xiǎn)因子。另外，無論痛風(fēng)患者的疾病活動(dòng)度如何，其滑液和血清中CXCL8水平均升高。

為深入了解薏苡仁-蒼術(shù)對(duì)RA和GA“異病同治”作用機(jī)制，使用R 語(yǔ)言對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析提示薏苡仁-蒼術(shù)“異病同治”RA和GA的生物過程主要涉及急性炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程及對(duì)脂多糖的反應(yīng)等，分子功能涉及蛋白磷酸酶結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路及TNF 信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路可激活炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等，如激活NF-κB，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥因子。IL-17在各種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，IL-17 信號(hào)通路參與了RA 患者M(jìn)MP13 的調(diào)控，從而參與了RA進(jìn)程中軟骨細(xì)胞的降解。Toll樣受體在RA及GA等風(fēng)濕性疾病的慢性炎癥中起重要作用，Toll樣受體信號(hào)通路大多依賴MyD88途徑，從而激活NF-κB，誘導(dǎo)促炎因子、趨化因子等。Gong等通過膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)追風(fēng)透骨膠囊通過TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)CRP水平、ESR和RFs進(jìn)而改善大鼠RA癥狀。段姮妃等以尿酸鈉注入大鼠右后踝關(guān)節(jié)誘導(dǎo)GA模型并予灌胃，發(fā)現(xiàn)清熱通絡(luò)方可下調(diào)TLRs信號(hào)通路相關(guān)蛋白TLR2、NF-κB表達(dá)水平，從而阻斷TLRs信號(hào)通路的激活，最終抑制炎癥因子釋放。

綜上所述，薏苡仁-蒼術(shù)治療RA和GA的靶點(diǎn)及通路極為相似，通過炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等多維網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，發(fā)揮“異病同治”作用。本研究可為薏苡仁-蒼術(shù)臨床治療以脾虛濕阻為病機(jī)的RA、GA及中醫(yī)“異病同治”提供依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)為理論研究，數(shù)據(jù)庫(kù)收錄局限可能影響其結(jié)果，且忽略了中藥組分在煎煮時(shí)可能發(fā)生的化學(xué)變化，有待今后深入分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。