柴胡疏肝散精簡方對慢性疼痛抑郁共病大鼠中縫核P2X7受體、Caspase-1及IL-1β表達的影響

許麗娥，高雪松，王安娜，杜儀，王永志，趙靜潔，2

1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合學系，北京 100050

研究顯示，慢性疼痛患者伴發(fā)重度抑郁的發(fā)生率約為52%，抑郁癥患者伴發(fā)疼痛的發(fā)生率約為65%。抑郁癥是一種以情緒低落和興趣喪失為特征的慢性精神疾病，具有高患病率、高復(fù)發(fā)率及自殺傾向。臨床上抑郁癥患者除情緒癥狀外，還會出現(xiàn)不同程度和表現(xiàn)的軀體疼痛。疼痛和抑郁常共同發(fā)病，并有累加效應(yīng)。因此，疼痛與抑郁共病受到越來越多的關(guān)注。疼痛抑郁共病屬中醫(yī)學“郁證”范疇，其病機為肝氣郁滯，氣機不暢，不通則痛，治療以疏肝解郁、行氣止痛為主，臨床多用柴胡疏肝散加減治療。

抑郁癥發(fā)病機制至今尚未闡明，炎癥假說近年備受關(guān)注。有學者認為，抑郁癥是神經(jīng)免疫炎癥疾病，炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，進而使外周感覺神經(jīng)敏感性增強，傳遞痛刺激的感受器過度敏化，導(dǎo)致痛覺過敏。P2X7受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞中高表達，其激活后可活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1，進而促進白細胞介素（IL）-1β等促炎因子釋放，在炎癥反應(yīng)及疼痛中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，柴胡疏肝散有較好的抗炎效果，但其能否通過下調(diào)P2X7 受體進而調(diào)節(jié)Caspase-1/IL-1β信號通路發(fā)揮作用尚不清楚。本研究采用利血平致慢性疼痛抑郁共病大鼠模型，觀察柴胡疏肝散精簡方對P2X7受體及Caspase-1/IL-1β信號通路的調(diào)節(jié)作用，揭示其抗抑郁止痛的部分機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于北京友誼醫(yī)院實驗動物中心，動物使用許可證號SYXK（京）2012-0023，溫度（21±1）℃，濕度30%～40%，12 h晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。

1.2 藥物

柴胡疏肝散精簡方（柴胡9 g，白芍15 g，枳殼9 g，香附9 g），免煎顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，用蒸餾水將免煎顆粒溶解，配制成濃度為1.6 g/mL混懸液。鹽酸氟西汀分散片，蘇州禮來制藥有限公司，批號4145A，用蒸餾水配制成0.4 mg/mL溶液。利血平注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司，批號2020905，用蒸餾水配制成0.1 g/L溶液。

1.3 主要試劑與儀器

超純RNA提取試劑、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture（With ROX）、DNase1、5×RNA Loading Buffer（北京康為世紀生物科技有限公司，貨號分別為CW0581、CW0744、CW0956、CW2090、CW0611A），總蛋白提取試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，貨號BB-3101），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020），IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體及IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（英國Abcam公司，貨號分別為ab233706、ab183218、ab234570、ab236712），β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（美國Immunoway公司，貨號分別為B1501、B0201）。分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司，型號NANODROP 2000），熒光定量PCR儀（杭州博日科技股份有限公司，型號Line Gene 9600 Plus），冰凍切片機（德國Leica公司，型號CM1950），超速低溫離心機（德國Sigma公司，型號Sigma-2K15），高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SCIENTZ-48），電泳儀（北京市六一儀器廠，型號DYY-7C），渦旋震蕩儀（上海其林貝爾儀器制造有限公司，型號VORTEX-6），轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司，型號170-3940），智能熱板儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司，型號YLS-6B）。

1.4 分組、造模及給藥

采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、氟西汀組和柴胡疏肝散精簡方組（精簡方組），每組10只，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。除空白組外，其余各組按0.3 mg/kg腹腔注射利血平制備慢性疼痛抑郁共病大鼠模型，空白組腹腔注射等量蒸餾水，每日1次，連續(xù)14 d。造模同時，按照成人與大鼠體表面積換算給藥劑量，氟西汀組按2 mg/kg灌胃氟西汀溶液，精簡方組按8 g/kg灌胃柴胡疏肝散精簡方混懸液，灌胃體積5 mL/kg，空白組及模型組灌胃等量蒸餾水。

1.5 大鼠體質(zhì)量檢測

分別測量大鼠給藥前后（實驗第1日及第14日）體質(zhì)量，計算體質(zhì)量增量。

1.6 強迫游泳實驗

給藥結(jié)束后，將大鼠逐只放入高60 cm、直徑30 cm透明玻璃桶內(nèi)（水深40 cm、水溫23～27 ℃），用攝像機記錄大鼠10 min的游泳錄像，由2位實驗人員采用盲法觀看游泳錄像5 min（第3～8 min），計錄大鼠強迫游泳不動時間，以四肢不動、漂浮于水面、僅頭部露出水面呼吸為大鼠不動狀態(tài)。

1.7 曠場實驗

給藥結(jié)束后，將大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm的四面涂黑曠場中，利用軟件將曠場分為4×4方格，攝像頭記錄大鼠行動軌跡，測定3 min內(nèi)大鼠運動總距離及穿格次數(shù)。

1.8 熱縮足閾值測定

給藥結(jié)束后，應(yīng)用智能熱板儀檢測大鼠熱痛敏感閾值，熱板儀溫度設(shè)定為（55±1）℃，將大鼠右后足底置于熱板儀上，以大鼠明顯縮足回避為陽性反應(yīng)，記錄大鼠縮足時間，同法測定大鼠左后足縮足時間，以左右兩側(cè)平均值作為該大鼠熱縮足閾值。

1.9 取材

1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，快速斷頭，于冰上頸動、靜脈混合取血，4 ℃靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。冰上分離大腦，參照大鼠腦立體定位圖譜定位中縫核并取出，放入干冰中預(yù)冷后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 ELISA檢測

采用ELISA 試劑盒檢測血清IL-6、TNF-α 含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.11 RT-PCR檢測

超純RNA提取試劑盒提取中縫核總RNA，進行RNA 電泳，用cDNA 合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，進行PCR擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、50 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.12 Western blot檢測

中縫核組織剪碎后置于1.5 mL EP管中，預(yù)冷PBS漂洗2次；加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），勻漿機勻漿后冰上裂解30 min；離心后取上清液，BCA法檢測蛋白濃度；樣品經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、TBST洗膜后，分別滴加IL-6一抗（1∶1 000）、TNF-α一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜4次，每次8 min；滴加相應(yīng)二抗（1∶5 000），37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜；ECL曝光后顯影，采用Image J 1.8.0軟件進行分析，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.13 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散精簡方對模型大鼠體質(zhì)量增量的影響

與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增量明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠體質(zhì)量增量明顯增加（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量增量比較（，每組10只）

2.2 柴胡疏肝散精簡方對模型大鼠強迫游泳不動時間的影響

與空白組比較，模型組大鼠強迫游泳不動時間明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠強迫游泳不動時間明顯減少（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠強迫游泳不動時間比較（，每組10只）

2.3 柴胡疏肝散精簡方對模型大鼠運動總距離及穿格次數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠曠場實驗運動總距離及穿格次數(shù)明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠運動總距離及穿格次數(shù)明顯增加（＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠曠場實驗運動總距離和穿格次數(shù)比較（，每組10只）

2.4 柴胡疏肝散精簡方對模大鼠熱縮足閾值的影響

與空白組比較，模型組大鼠熱縮足閾值明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠熱縮足閾值明顯升高（＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠熱痛縮足閾值比較（，s）

2.5 柴胡疏肝散精簡方對模大鼠血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠血清IL-6、TNF-α 含量明顯減少（＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（，每組10只）

2.6 柴胡疏肝散精簡方對模大鼠中縫核P2X7 受體、Caspase-1及白細胞介素-1β mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠中縫核P2X7 受體、Caspase-1 及IL-1β mRNA 表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠中縫核P2X7受體、Caspase-1及IL-1β mRNA表達明顯降低（＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠中縫核P2X7受體、Caspase-1及IL-1β mRNA表達比較（）

2.7 柴胡疏肝散精簡方對模型大鼠中縫核白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠中縫核IL-6、TNF-α蛋白表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組和精簡方組大鼠中縫核IL-6、TNF-α蛋白表達明顯降低（＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠中縫核IL-6、TNF-α蛋白表達比較（，每組10只）

3 討論

目前關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機制尚不清楚，主要有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、神經(jīng)受體假說、神經(jīng)營養(yǎng)和可塑性假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說、神經(jīng)免疫炎癥假說等。免疫炎癥假說越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥通常伴有炎癥、自身免疫反應(yīng)、氧化和亞硝化應(yīng)激反應(yīng)及神經(jīng)退行性病變等，而這些反應(yīng)部分是由IL-1水平升高引起。炎癥因子可激活吲哚胺2,3 雙加氧酶（IDO），IDO的激活又使合成5-羥色胺（5-HT）的原料色氨酸通過犬尿氨酸代謝通路消耗，從而降低5-HT的合成，進而出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn)。P2X7受體是嘌呤受體的一個亞型，為ATP控制的離子通道，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達豐富，被ATP激活后導(dǎo)致K外流和Ca內(nèi)流，及非選擇性膜孔形成，啟動一系列信號途徑如炎癥小體NLRP3活化、Caspase-1和核因子-κB激活等，增強炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎性因子釋放，參與炎癥發(fā)生發(fā)展。同時P2X7受體還參與疼痛的調(diào)節(jié)。

中醫(yī)認為，疼痛抑郁共病基本病機為肝郁氣滯，不通則痛，臨床以疏肝類中藥復(fù)方治療，效果顯著。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，用于“治脅肋疼痛，寒熱往來”，為經(jīng)典疏肝理氣劑，具有疏肝解郁、行氣止痛功效。原方為“醋炒陳皮、柴胡各二錢，川芎、麩炒枳殼、芍藥各一錢半，炙甘草五分，香附一錢半”，“水一盅半，煎八分，食前服”。柴胡疏肝散具有較好的抗炎作用，不僅可降低外周血炎癥因子IL-6、TNF-α含量，還可減少中縫核IL-6、TNF-α蛋白表達，通過抑制炎癥因子的釋放抑制IDO 激活，從而促進5-HT合成，但其發(fā)揮抗炎作用的上游分子機制尚不清楚。P2X7受體作為啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，柴胡疏肝散是否通過影響該靶點發(fā)揮抗炎作用，目前缺少明確研究。本研究使用柴胡疏肝散精簡方是根據(jù)原方進行化裁，由柴胡9 g、白芍15 g、枳殼9 g、香附9 g組成，增加君藥柴胡劑量以增強疏肝解郁之功，增加枳殼、香附劑量而重理氣，重用白芍以養(yǎng)血柔肝，同時去掉辛燥之川芎、理氣之陳皮。本研究結(jié)果顯示，精簡方組大鼠中縫核P2X7 受體、Caspase-1、IL-1β mRNA及IL-6、TNF-α蛋白表達明顯降低，提示柴胡疏肝散精簡方可能通過抑制P2X7受體及Caspase-1/IL-1β表達，抑制中縫核炎癥因子釋放，從而發(fā)揮抗疼痛抑郁功效。

綜上所述，柴胡疏肝散精簡方可通過降低慢性疼痛抑郁共病大鼠中縫核P2X7受體mRNA表達，進而抑制Caspase-1/IL-1β 通路，降低中縫核及血清IL-6、TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)，提高大鼠痛閾值及改善抑郁行為。