復(fù)合酶制劑對(duì)地方種雞繁殖性能及腸道的影響

朱 敏，陸素寧，賈肖軒，李小寧，彭 昊，廖玉英通信作者

(1.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001)

0 引言

養(yǎng)雞業(yè)是畜禽業(yè)的重要組成部分，在畜牧產(chǎn)業(yè)中具有極其重要的地位。地方雞則是我國(guó)寶貴的遺傳資源，經(jīng)過(guò)多年的開(kāi)發(fā)利用和科學(xué)飼養(yǎng)獲得了品質(zhì)更好、口感更佳、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的雞肉和雞蛋等農(nóng)副產(chǎn)品。

酶是生物體中具有高效率催化效應(yīng)的生物分子，在其作用下可以推動(dòng)其專(zhuān)屬的生化反應(yīng)。其中蛋白酶是針對(duì)蛋白特定區(qū)域，將蛋白分解為肽段的酶類(lèi)。蛋白質(zhì)是生命體實(shí)現(xiàn)生育功能的基本部分，而蛋白的基本構(gòu)成是氨基酸，氨基酸依照一定順序串聯(lián)形成肽鏈，肽鏈根據(jù)氨基酸的殘基之間形成的分子作用力維持特有的肽鏈特異結(jié)構(gòu)組合成蛋白質(zhì)。正常情況下絕大部分生物體具有數(shù)量大而種類(lèi)各異的酶群體，可以用于消化吸收生物體采食的食物中的蛋白部分，而酶種類(lèi)越豐富吸收越徹底。

抗生素是針對(duì)微生物繁殖開(kāi)發(fā)出的化學(xué)制劑，應(yīng)用在養(yǎng)殖中可有效降低各類(lèi)致病微生物感染的可能，從而減少損失。但是抗生素會(huì)加快微生物自然篩選過(guò)程，導(dǎo)致超級(jí)病原微生物的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)及動(dòng)物的生命安全。因此，國(guó)家出臺(tái)了相關(guān)政策，禁止在飼料中添加抗生素，該政策的實(shí)施對(duì)畜禽業(yè)發(fā)展具有正面意義，但短期內(nèi)對(duì)禽畜的健康成長(zhǎng)提出了更大的挑戰(zhàn)。生物體內(nèi)普遍存在著一系列能抵抗外來(lái)物質(zhì)甚至是微生物入侵的機(jī)制，即免疫系統(tǒng)。通過(guò)具有特定功能的細(xì)胞識(shí)別接觸到的物質(zhì)是否來(lái)自外界的非法入侵，也有特定功能的細(xì)胞執(zhí)行異物的收集與清除。免疫細(xì)胞的壽命有限，執(zhí)行一定量的免疫工作后會(huì)老化死亡，最終外排。因而，整套免疫系統(tǒng)會(huì)消耗生物體內(nèi)的蛋白儲(chǔ)量。有試驗(yàn)證明酶制劑可以補(bǔ)充家禽體內(nèi)缺乏的酶、提高飼料的利用率并抵消抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面影響[1-2]。合理的益生菌輔助可以改善畜禽的生產(chǎn)性能[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)使用復(fù)合酶制劑從營(yíng)養(yǎng)和免疫兩個(gè)層面去嘗試提高地方種雞的養(yǎng)殖水平，通過(guò)統(tǒng)計(jì)種雞的繁殖性能、消化道菌群構(gòu)成及腸道結(jié)構(gòu)變化，探討復(fù)合酶制劑對(duì)地方種雞繁殖性能及腸道的影響，為生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由廣西立騰農(nóng)牧有限公司提供的250日齡地方種雞。

試驗(yàn)用酶制劑：試驗(yàn)用的復(fù)合酶制劑主要由蛋白酶和益生菌按一定比例配制而得，酶主要有枯草桿菌蛋白酶、α-D-半乳糖水解酶、Gly-Gly內(nèi)肽酶、堿性蛋白酶P6、α淀粉酶等；益生菌以枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌為主要成分。

1.2 試驗(yàn)分組及處理

用同一日齡試驗(yàn)雞360只，隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組在日糧中以飼料與酶1 000:1的比例添加復(fù)合酶制劑，混合均勻得到實(shí)驗(yàn)飼料，用于實(shí)驗(yàn)組的喂養(yǎng)，對(duì)照組飼喂日常日糧。所有試驗(yàn)雞日常管理采用廣西立騰農(nóng)牧有限公司的養(yǎng)殖管理方案。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定

1.3.1 繁殖性能數(shù)據(jù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間每日收集記錄各組實(shí)驗(yàn)雞所產(chǎn)種蛋，記錄產(chǎn)蛋數(shù)、種蛋合格數(shù)，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋率、種蛋合格率、種蛋受精率、孵化率、受精蛋孵化率等指標(biāo)。

1.3.2 腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.2.1 基因組提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組十二指腸及空腸內(nèi)容物進(jìn)行DNA的提取。

1.3.2.2 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

以提取的樣品總DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增樣品中16S rDNA的V3、V4可變區(qū)。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：2×ES Taq Master Mix 25 μL，DNA模板4 μL，上、下游引物各2 μL，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行文庫(kù)制備；對(duì)測(cè)序結(jié)果原始圖像數(shù)據(jù)利用軟件Bcl2fastq(v2.17.1.14)進(jìn)行圖像堿基識(shí)別(Base Calling)，初步質(zhì)量分析，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭和低質(zhì)量過(guò)濾處理，然后去除嵌合體序列，得到高質(zhì)量的有效序列；對(duì)優(yōu)化后的數(shù)據(jù)提取unique序列，在97%的相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析；基于OTU的分類(lèi)結(jié)果，對(duì)不同樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)分別進(jìn)行α多樣性分析，α多樣性可以反映微生物群落中物種的數(shù)目，通過(guò)一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)指數(shù)(ACE，Chao1，Shannon，Simpson)的分析來(lái)估計(jì)不同腸道段中微生物群落豐度和多樣性。測(cè)序深度(Coverage)指數(shù)Good′s Coverage可以反映各產(chǎn)品文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越接近于1，產(chǎn)品中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。

1.3.2.4 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定

隨機(jī)選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3只試驗(yàn)雞分別進(jìn)行十二指腸與空腸取樣，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后鏡檢觀察絨毛形態(tài)。用顯微鏡在40、100倍下隨機(jī)選擇多個(gè)非連續(xù)性視野觀察切片，并挑選典型視野拍攝成圖片，比較各組雞腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)，測(cè)量腸道的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度以及兩者的比值(絨隱比)。絨毛高度由絨毛頂端至絨毛隱窩交界處測(cè)量，隱窩深度定義為相鄰絨毛內(nèi)陷的深度。絨毛高度的增加表明絨毛吸收能力增強(qiáng)；隱窩深度表示細(xì)胞生成率，隱窩越淺表明細(xì)胞成熟率越好，分泌功能越強(qiáng)。絨毛高度與隱窩深度的比值表示腸道內(nèi)表面積，比值越大，表面積越大，越有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

1.3.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

對(duì)多項(xiàng)繁殖數(shù)據(jù)使用R語(yǔ)言進(jìn)行批量單因素方差分析，對(duì)消化道相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)中P<0.05表示顯著差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 種雞繁殖性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

種雞繁殖性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)組的產(chǎn)蛋量相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有優(yōu)勢(shì)；但種蛋合格率、種蛋孵化率、受精蛋孵化率均略高于對(duì)照組，差異不顯著；種蛋孵化率試驗(yàn)組高于對(duì)照組1.96%，差異顯著。說(shuō)明復(fù)合酶添加劑處理的實(shí)驗(yàn)組對(duì)提高種蛋質(zhì)量、提高繁殖性能有促進(jìn)作用。

表1 種雞生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 高通量測(cè)序?qū)δc道原核微生物的α多樣性分析

按照97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)，根據(jù)OTU聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)不同腸道段的α多樣性指數(shù)取平均值后進(jìn)行α多樣性分析，具體如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組十二指腸與空腸α多樣性指數(shù)

由表2可知，本試驗(yàn)中平均Coverage指數(shù)均達(dá)到1，說(shuō)明不同腸道段樣品測(cè)序的深度和廣度符合要求，測(cè)序獲得的相關(guān)序列能較好地反應(yīng)菌群的真實(shí)情況。實(shí)驗(yàn)組空腸內(nèi)微生物各項(xiàng)α多樣性指數(shù)均高于對(duì)照組，表明在基礎(chǔ)日糧中添加超敏復(fù)合蛋白酶可提高空腸微生物群落豐度及多樣性。對(duì)ACE及Chao1指數(shù)分析可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組十二指腸此類(lèi)指標(biāo)平均值均高于對(duì)照組，但差異并不顯著，表明添加超敏復(fù)合蛋白酶具有促進(jìn)十二指腸微生物豐度提高的趨勢(shì)。

2.3 門(mén)水平下雞各腸道段的菌群結(jié)構(gòu)分析

門(mén)水平上各物種平均百分比如表3所示。菌群結(jié)構(gòu)門(mén)水平上各物種對(duì)十二指腸而言，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均以厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但相較于對(duì)照組而言，實(shí)驗(yàn)組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度有所提高?？漳c中的菌群分布在樣本間差異較大，對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)與厚壁菌門(mén)，實(shí)驗(yàn)組絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)，相對(duì)含量高達(dá)94.91%。說(shuō)明該復(fù)合酶制劑可顯著提升空腸中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度。

表3 各樣本在門(mén)水平的各物種平均百分比統(tǒng)計(jì)表 單位：%

2.4 屬水平下雞各腸道段的菌群結(jié)構(gòu)分析

在基礎(chǔ)日糧中添加超敏復(fù)合酶制劑對(duì)地方種雞屬水平下各腸道段微生物相對(duì)豐度的影響如表4所示。由表4可知，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各腸道段菌屬分布不一致，且樣本間差異較大。乳酸乳球菌屬與乳桿菌屬是十二指腸的主要菌屬，且乳桿菌屬平均占比高達(dá)60%以上，添加復(fù)合酶制劑后，乳酸乳球菌屬與乳桿菌屬的相對(duì)豐度均明顯下降，片球菌屬的含量顯著提高，且為十二指腸的最主要菌屬。對(duì)空腸腸道微生物相對(duì)豐度分析表明，相較于對(duì)照組而言，實(shí)驗(yàn)組絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬，平均占比高達(dá)90%以上。此外，對(duì)照組不同腸道段中含有不同程度的潛在致病菌，如大腸桿菌-志賀氏菌屬等，在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合酶制劑可顯著降低腸道致病菌的相對(duì)豐度，減少腸道致病風(fēng)險(xiǎn)。

表4 各樣本在屬水平的各物種平均百分比統(tǒng)計(jì)表 單位：%

2.5 腸道形態(tài)結(jié)果分析

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組十二指腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度及絨隱比未表現(xiàn)出顯著差異；實(shí)驗(yàn)組空腸絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)，隱窩深度降低，絨隱比顯著提升(見(jiàn)表5)?？漳c是雞腸道營(yíng)養(yǎng)吸收的主要區(qū)域，延長(zhǎng)絨毛高度并縮短隱窩可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)腸道抗病能力，由此說(shuō)明飼喂復(fù)合蛋白酶能改善雞空腸的消化及吸收能力。雞腸道鏡檢圖如圖1所示。

表5 添加復(fù)合蛋白酶對(duì)雞腸道各段形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 實(shí)驗(yàn)雞腸道鏡檢圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明，在地方種雞產(chǎn)蛋期飼料中添加1‰的復(fù)合酶添加劑能提高種雞的繁殖性能，綜合本次試驗(yàn)結(jié)果與腸道菌落、雞腸絨毛結(jié)構(gòu)等解剖學(xué)信息，認(rèn)為該復(fù)合酶有促進(jìn)作用，但可能試驗(yàn)期短，使用時(shí)間不長(zhǎng)，并未在繁殖性能上表現(xiàn)出更為顯著差異。從腸道菌群發(fā)生了初步調(diào)整到影響產(chǎn)蛋量需要一定的時(shí)間方可形成，只是1個(gè)月的酶菌復(fù)合物處理還沒(méi)有讓其產(chǎn)生足夠變化，所以在種雞日糧中添加復(fù)合酶制劑對(duì)種雞的產(chǎn)蛋量影響不明顯，對(duì)種蛋的質(zhì)量如種蛋合格率、孵化率效果比較顯著?？赡芩淖饔檬紫扔绊懛N雞的健康狀況，表現(xiàn)出的是種蛋的質(zhì)量，對(duì)產(chǎn)蛋量還需要更長(zhǎng)時(shí)間的調(diào)整，試驗(yàn)結(jié)果與Cowison等[4]通過(guò)添加酶制劑顯著提高肉雞的生產(chǎn)性能結(jié)果一致，但提高程度也與飼料的成分比例及添加的時(shí)間有關(guān)，添加時(shí)間及添加量還需進(jìn)一步探討。另一個(gè)角度說(shuō)明此類(lèi)產(chǎn)品更適合用于長(zhǎng)期使用，最好在產(chǎn)蛋初期就開(kāi)始投放，改良作用也許更明顯。本次試驗(yàn)只代表對(duì)產(chǎn)蛋末期的種雞群使用酶菌復(fù)合物添加劑的影響，對(duì)整個(gè)產(chǎn)蛋階段的影響及作用機(jī)理都有待剖析，至于最佳的酶菌比例構(gòu)成則有待進(jìn)一步研究。

在地方雞日糧中添加復(fù)合酶制劑后，試驗(yàn)組腸道優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬，平均占比高達(dá)90%以上，對(duì)照組不同腸道段中含有不同程度的潛在致病菌，如大腸桿菌-志賀氏菌屬等，說(shuō)明在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合酶制劑可顯著提高腸道有益菌群，降低腸道致病菌的相對(duì)豐度，減少腸道致病風(fēng)險(xiǎn)，提高種雞抗病能力。

通過(guò)對(duì)腸道結(jié)構(gòu)的對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組空腸絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)，隱窩深度降低，絨隱比顯著提升?？漳c是雞腸道營(yíng)養(yǎng)吸收的主要區(qū)域，延長(zhǎng)絨毛高度并縮短隱窩可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)腸道抗病能力，由此說(shuō)明飼喂復(fù)合蛋白酶能改善雞空腸的消化及吸收能力。

4 結(jié)語(yǔ)

在地方種雞日糧中添加復(fù)合酶制劑，可提高種蛋的品質(zhì)，提高種蛋孵化率較明顯，有促進(jìn)繁殖性能提高的作用；同時(shí)改變了種雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了腸道健康，提高了種雞健康度；也改變了腸道的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)日糧中的營(yíng)養(yǎng)更容易被消化和吸收。但其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。