生物炭對(duì)巖溶區(qū)黃龍病臍橙園土壤N2O排放的影響

岳鵬鵬, 付 燦, 江曉雨, 王 蓉, 黃雅丹

1)桂林醫(yī)學(xué)院智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 廣西桂林 541199; 2)桂林醫(yī)學(xué)院研究生院, 廣西桂林 541199

溫室氣體排放增加導(dǎo)致全球氣候變暖, 引發(fā)嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題(Field et al., 2014)。氧化亞氮(N2O)是引起升溫效應(yīng)的主要溫室氣體之一, 其在大氣中存在壽命較長(zhǎng), 等摩爾濃度增溫潛勢(shì)強(qiáng)(Thomson et al.,2012; Fuertes-Mendizábal et al., 2019), 已引起越來(lái)越多的關(guān)注和減排研究(Shakoor et al., 2021; Shan et al., 2021)。

土壤是大氣N2O的主要排放源, 尤其是溫暖區(qū)農(nóng)業(yè)土壤(Liu et al., 2016)。中國(guó)柑橘的種植面積居世界第一, 其種植過(guò)程中存在氮肥輸入量大、土壤酸化普遍(張影, 2014)和土壤 N2O排放量較大的特點(diǎn)。廣西是我國(guó)最重要的柑橘種植區(qū)之一, 也是全國(guó)巖溶面積分布最廣的地區(qū)之一。由碳酸鹽巖發(fā)育而來(lái)的巖溶土壤具有富鈣、粘重等特點(diǎn), 進(jìn)而其柑橘園土壤氮轉(zhuǎn)化相對(duì)于其他農(nóng)業(yè)土壤具有一定的特殊性(楊會(huì)等, 2020)。黃龍病是柑橘生產(chǎn)中最具毀滅性的病害(Das et al., 2021), 患病植株可進(jìn)一步影響根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu), 進(jìn)而擾動(dòng)土壤N2O排放,增加溫室氣體排放風(fēng)險(xiǎn)。

N2O主要產(chǎn)生于土壤微生物介導(dǎo)的硝化和反硝化過(guò)程(Huang et al., 2014; Conthe et al., 2018), 是土壤氮循環(huán)的中間產(chǎn)物。土壤中硝化和反硝化微生物的活動(dòng)直接影響N2O通量的源匯效應(yīng)。生物炭是生物質(zhì)在缺氧或無(wú)氧條件下熱解轉(zhuǎn)化而成的固體產(chǎn)物(Harter et al., 2014), 輸入土壤可同時(shí)實(shí)現(xiàn)降低土壤酸度、促進(jìn)植物生長(zhǎng)(Sheikhi et al., 2020)、增加碳封存等有益影響, 是目前在有效性和可持續(xù)性方面最受關(guān)注的土壤改良和減排措施。盡管已有研究證明生物炭輸入可降低土壤N2O的排放, 這主要?dú)w因于生物炭對(duì)反硝化微生物的調(diào)節(jié)作用(Zhang et al., 2021)。但也有研究顯示生物炭可通過(guò)增加氨氧化細(xì)菌(AOB)等硝化相關(guān)微生物的豐度和加速總硝化率最終削弱其N(xiāo)2O減排效果甚至產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)(Sun et al., 2021)。不同土地利用類(lèi)型和不同土壤健康狀況下生物炭添加對(duì)土壤 N2O排放的影響程度及其微生物調(diào)節(jié)途徑存在一定差異。生物炭作為土壤改良劑常用于黃龍病柑橘園土壤的改良, 但其對(duì)巖溶區(qū)黃龍病柑橘園土壤 N2O排放的影響及微生物調(diào)節(jié)途徑, 目前尚不清楚。

鑒于此, 本文擬以廣西巖溶區(qū)黃龍病臍橙園土壤為研究對(duì)象, 通過(guò)土壤培育等方法, 量化生物炭對(duì)該土壤N2O排放、氮素凈硝化率和礦化率、硝化和反硝化功能基因豐度的影響, 分析其相互關(guān)系并明確影響N2O排放主要因子。研究結(jié)果可為巖溶區(qū)黃龍病柑橘園土壤 N2O減排及調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 土壤采集與生物炭制備

供試土壤采集于廣西壯族自治區(qū)賀州市富川縣6年樹(shù)齡典型黃龍病紐荷爾臍橙園。富川縣位于廣西東北部, 屬亞熱帶季風(fēng)氣候, 年均氣溫 19℃,年均降雨量1700 mm, 無(wú)霜期318 d, 是臍橙優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。春季 3月份采集樣品, 在黃龍病臍橙樹(shù)株滴水線四個(gè)方向分別采集0-20 cm土壤并混勻。去除樹(shù)根和石頭后過(guò)2 mm土壤篩, 用于土壤培育和理化參數(shù)測(cè)定。其中, pH值測(cè)定采用電位法(土水比例為1:2.5)測(cè)定; 土壤 NH4+-N、-N通過(guò)連續(xù)流動(dòng)分析儀(SEAL AA3, 德國(guó))測(cè)定(委托廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院測(cè)定); 土壤有機(jī)碳、總氮分別通過(guò)重鉻酸鉀氧化容量法和凱氏定氮法(FOSS KJELTEC 8420, 丹麥)測(cè)定(委托廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院測(cè)定)。田間持水量通過(guò)環(huán)刀法測(cè)定。

生物炭購(gòu)自河南弘之源凈水材料有限公司, 以玉米芯為原料在450°C無(wú)氧條件下熱解6 h制得。過(guò) 100目篩, 按照與土壤樣品相同的方法分析了生物炭的理化參數(shù), 包括硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有機(jī)碳和總氮(表1)。

表1 土壤和生物炭的理化參數(shù)Table 1 Physical and chemical parameters of soil and biochar

1.2 土壤培育試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室土壤培育設(shè) 5個(gè)生物添加處理, 其生物炭添加量分別為: 0(CK), 1%(B1), 2%(B2), 5%(B3),10%(B4)。各處理 3次重復(fù)、4次破壞性取樣, 共5×3×4=60個(gè)培養(yǎng)瓶(250 mL血清瓶)。稱(chēng)取相當(dāng)于25 g干土的土壤/土壤-生物炭混合物置于培養(yǎng)瓶中,根據(jù)土壤含水量和田間持水量(water capacity holding, WHC, 水/烘干土×100% =25.70%), 用去離子水調(diào)整培養(yǎng)土含水量為80%WHC。每瓶用帶6針孔封口膜封口靜置, 于 27℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)28 d, 培養(yǎng)過(guò)程中每2天稱(chēng)重法補(bǔ)充水分。

在0 d, 1 d, 2 d, 4 d, 7 d, 14 d, 21 d和28 d通過(guò)培養(yǎng)瓶頂部 N2O的濃度變化來(lái)測(cè)定 N2O排放量。每次取樣前去掉培養(yǎng)瓶封口膜通風(fēng) 1 h, 用丁基膠塞密封后立即用帶三通閥的注射器抽氣15 mL取得第一個(gè)氣體樣品, 4 h后采集第二個(gè)氣體樣品。使用氣相色譜儀(Agilent7890B, 美國(guó))測(cè)定樣品中 N2O的濃度。N2O 排放速率計(jì)算公式為:E=P×V×(Δc/Δt)×(1/RT)×M×(1/m), 其中E表示 N2O排放速率(ug·kg-1·h-1),P表示標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(pa),V表示培養(yǎng)瓶頂部空間的體積(V=培養(yǎng)瓶體積V瓶－培養(yǎng)土體積V土, cm3),c表示N2O的濃度(×10-6),t是兩次采樣之間的時(shí)間(h), R表示通用氣體常數(shù), T表示絕對(duì)空氣溫度(K),M是的N2O的分子量(g·mol-1),m是土壤質(zhì)量(干重)(kg)(Hu et al., 2017; Deng et al.,2019)。兩次測(cè)定間隔內(nèi) N2O排放量為兩次平均排放速率與時(shí)間(h)的乘積, N2O累積排放量為不同時(shí)間段氣體排放量的總和(ug·kg-1)(崔靜雅等, 2017)。

在0 d, 7 d, 14 d, 28 d破壞性取土樣置于-80℃保存, 用于測(cè)定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮, 硝化、反硝化功能基因拷貝數(shù)。氮素凈硝化和氮礦化率用下列公式計(jì)算(Li et al., 2017): NNR=(Nf-N0)/T, NMR=(Nf+Af-N0-A0)/T, 其中, NNR, NMR分別為土壤培育時(shí)間內(nèi)土壤氮素的凈硝化率和凈礦化率(mg·kg-1·d-1),Nf和N0分別代表培養(yǎng)結(jié)束和初始時(shí)含量(mg·kg-1),Af和A0分別代表培養(yǎng)結(jié)束和初始時(shí)含量(mg·kg-1),T表示培養(yǎng)的天數(shù)(d)。土壤DNA通過(guò)DNeasy?Power Soil?土壤DNA提取試劑盒(QIAGEN, 美國(guó))提取。功能基因(包括AOA-amoA, AOB-amoA,nirK,nosZ)拷貝數(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得(BIO-RAD CFX96, 美國(guó))。各功能基因擴(kuò)增引物情況如表2, 最后通過(guò)每克干土中所含功能基因的拷貝數(shù)表示功能基因豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

土壤 N2O排放和土壤理化參數(shù)通過(guò) Microsoft Office Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性性分析通過(guò)SPSS21.0軟件LSD方差分析進(jìn)行。土壤N2O排放速率(三個(gè)重復(fù))與各土壤因子(包括含量和各功能基因豐度)的關(guān)系通過(guò)除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended Correspondence Analysis, DCA)進(jìn)行研究(PCORD 5.0)。

表2 功能基因qPCR擴(kuò)增引物Table 2 Primers used for qPCR amplification of functional genes

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對(duì)土壤 N2O排放速率和累積排放量的影響

添加生物炭可降低土壤 N2O平均排放速率和累積排放量(圖1), 但各處理間無(wú)顯著差異。平均降低幅度和添加生物炭的量有關(guān), 當(dāng)生物炭添加量為5%時(shí), N2O平均排放速率和累積排放量降幅最大分別達(dá)到14.39%和37.04%。

圖1 生物炭對(duì)土壤N2O排放速率(A)和累積排放量(B)的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理; 圖中不同字母代表差異顯著(P＜0.05))Fig. 1 The effects of adding biochar on soil N2O emission rates (A) and cumulative emissions (B) (CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments; different letters represent significant differences (P＜0.05))

2.2 生物炭對(duì)土壤氮素凈硝化率和礦化率的影響

生物炭添加對(duì)土壤氮素平均凈硝化率和礦化率均產(chǎn)生了影響(圖2)。隨著生物炭添加量的增加,土壤氮素凈硝化率先增加后降低, 在生物炭添加量為2%(B2)時(shí)提高了196.64%, 但在生物炭添加量≧5%(B3、B4)時(shí), 硝化率反而降低。另一方面, 添加生物炭后土壤氮素礦化率顯著提高, 由 CK的負(fù)值變?yōu)檎? 且在生物炭添加量為 5%時(shí)礦化率提高達(dá)到峰值, 不同處理間存在極顯著差異。

圖2 生物炭對(duì)土壤凈氮硝化率和礦化率的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理, 圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P＜0.05), 不同大寫(xiě)字母代表差異極顯著(P＜0.01))Fig. 2 The effects of adding biochar on soil net nitrogen nitrification rates and mineralization rates (CK, B1, B2, B3,and B4 represent different biochar addition treatments,different lowercase letters represent significant differences(P＜0.05), and different capital letters represent extremely significant differences (P＜0.01))

2.3 生物炭對(duì)功能基因拷貝數(shù)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果顯示(圖3), 巖溶區(qū)黃龍病臍橙園酸性土壤硝化(AOA-amoA和AOB-amoA)和反硝化相關(guān)功能基因(nosZ和nirK)豐度均隨生物炭添加量增加先增加后降低, 在添加量為 2%時(shí)(B2)達(dá)到峰值。其中, 氨氧化古菌AOA-amoA基因的拷貝數(shù)(3.72×1011±0.69×1011)顯著高于氨氧化細(xì)菌 AOB-amoA基因(3.38×109±0.98×109) (P＜0.01), 且后期降幅相對(duì)較小, 在B2、B3、B4中均維持較高拷貝數(shù)(三個(gè)處理間無(wú)顯著差異)。反硝化最后一步限速功能基因nosZ拷貝數(shù)((4.28±0.82)×1011g-1干燥土壤)顯著高于另一反硝化相關(guān)基因nirK((5.55±1.14)×1010g-1干燥土壤)(P＜0.01)。nosZ拷貝數(shù)在B1、B2中顯著高于CK,nirK拷貝數(shù)B4中低于CK且在各處理間無(wú)顯著差異。

圖3 生物炭對(duì)功能基因AOA-amoA(A), AOB-amoA(B), nosZ(C), nirK(D)拷貝數(shù)的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理; 圖中不同字母代表差異顯著(P＜0.05))Fig. 3 Effects of biochar on the copy numbers of functional genes, including AOA-amoA(A), AOB-amoA(B), nosZ(C), and nirK(D)(CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments; different letters represent significant differences (P＜0.05))

2.4 生物炭添加不同處理土壤 N2O排放速率與土壤因子排序

不同處理的 N2O平均排放速率和土壤因子變量的DCA排序結(jié)果較直觀的展示了N2O排放和各因子的關(guān)系(圖4)。其中,、nirK拷貝數(shù)以及nosZ拷貝數(shù)與N2O排放速率負(fù)相關(guān), AOA-amoA拷貝數(shù)、與土壤N2O排放速率正相關(guān)。CK與B1排放速率相似, 生物炭添加量增加后, B2、B3和B4的N2O排放速率特征在排序第一軸和第二軸均顯示了一定差異, 在第一軸主要受的影響, 在排序第二軸主要受nosZ拷貝數(shù)的影響。然而, AOA-amoB拷貝數(shù)在排序第一軸和第二軸均未表現(xiàn)出明顯的排列規(guī)律。

圖4 生物炭添加不同處理土壤N2O排放速率與土壤因子DCA排序圖(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理, NH4+-N、-N分別代表土壤中NH4+-N、-N的質(zhì)量分?jǐn)?shù), AOA-amoA, nirK, nosZ代表分別代表AOA-amoA, nirK, nosZ基因拷貝數(shù))Fig. 4 DCA ordination diagram of soil N2O emission rates and soil factors with different treatments of biochar addition (CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments, NH4+-N、-N represent the mass fractions of NH4+-N and -N in the soil, and AOA-amoA, nirK, and nosZ represent the number of copies of AOA-amoA, nirK, and nosZ genes, respectively)

3 討論

本研究中, 生物炭添加改變了土壤氮素凈硝化率/礦化率、反硝化相關(guān)功能基因nosZ和硝化相關(guān)功能基因 AOA-amoA、AOB-amoA的豐度, 且添加量為 2%時(shí)是多數(shù)指標(biāo)增長(zhǎng)的峰值, 與對(duì)照差異顯著, 提示 2%生物炭添加量是其調(diào)節(jié)土壤氮轉(zhuǎn)化的活躍點(diǎn)。

AOA和AOB驅(qū)動(dòng)的氨氧化作用是硝化作用的限速步驟, 在土壤 N2O產(chǎn)生中起重要作用(Caranto et al., 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)生物炭添加增加了AOA-amoA和AOB-amoA基因拷貝數(shù), 這與有些研究中生物炭添加會(huì)增加硝化功能基因豐度、加速總硝化率最終削弱其N(xiāo)2O減排效果(Sun et al., 2021)的結(jié)果基本一致。值得注意的是隨著生物炭添加量的增加, AOB-amoA拷貝數(shù)先增加后降低, 與土壤氮素凈硝化率變化一致。而AOA-amoA拷貝數(shù)無(wú)顯著降低, 對(duì)N2O排放速率影響更顯著, 顯示出本研究條件下AOA對(duì)生物炭添加的敏感性。

本研究中, 添加生物炭降低了巖溶區(qū)臍橙園土壤N2O平均排放速率和累積排放量, 但各處理間無(wú)顯著差異, 可能與生物炭對(duì)反硝化和硝化相關(guān)功能基因的雙向刺激有關(guān)。AOA-amoA和nosZ、nirK基因豐度反向作用于土N2O排放速率, 最終形成本文中添加生物炭后 N2O排放速率和累計(jì)排放量的差異狀態(tài)。今后若要進(jìn)一步提高生物炭對(duì)巖溶區(qū)黃龍病柑橘園土壤N2O減排的效應(yīng), 可以考慮通過(guò)添加硝化抑制劑等手段降低生物炭對(duì)硝化菌或硝化途徑的刺激作用。

4 結(jié)論

(1)生物炭添加顯著改變了土壤氮素凈硝化率/礦化率, 反硝化相關(guān)功能基因nosZ和硝化相關(guān)功能基因 AOA-amoA、AOB-amoA的豐度, 且生物炭添加量為2%時(shí)是多數(shù)指標(biāo)增長(zhǎng)的峰值。

(2)添加生物炭降低了巖溶區(qū)臍橙園土壤 N2O的平均排放速率和累積排放量, 但各處理間差異不顯著。這與生物炭添加對(duì)硝化相關(guān)功能基因AOA-amoA(增加N2O排放)的激發(fā)作用有關(guān)。

(3)生物炭添加不同處理 N2O的排放速率主要受含量、nirK豐度、nosZ豐度的負(fù)向影響,含量和AOA-amoA豐度的正向影響。若要進(jìn)一步提升生物炭對(duì)該土壤的減排效果, 應(yīng)注意提升土壤水平和反硝化相關(guān)功能基因豐度, 抑制土壤水平和硝化相關(guān)功能基因 AOA-amoA的豐度。

致謝:本文樣品采集工作得到桂林醫(yī)學(xué)院李劍橋同志的大力支持和幫助, 特此致謝！

Acknowledgements:

This study was supported by the Guangxi Youth Science Foundation Project (No. 2018JJB150056), and the Guangxi Science and Technology Base and Talent Special Project (No. 2020AC20045).