imFISH循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與惡性腫瘤患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系*

李 敏，豆小文，劉 丹，熊 丹，張秀明△

1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)羅湖區(qū)人民醫(yī)院/深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001；3.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)羅湖區(qū)人民醫(yī)院/深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院甲乳外科，廣東深圳 518001

2020年，全球新發(fā)惡性腫瘤病例約1 930萬(wàn)例，死亡病例達(dá)1 000萬(wàn)例，呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，全球女性乳腺癌新發(fā)病率已超過肺癌成為排名第一的惡性腫瘤；我國(guó)乳腺癌發(fā)病例數(shù)高居全球第一位，死亡率位居前列的惡性腫瘤依次為肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[1]。病理活檢雖為診斷惡性腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)患者有侵入性損傷，取材位置有限，無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；影像學(xué)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者病情，但對(duì)微小病變無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別(可檢出病變的最小直徑為2～3 mm)，對(duì)患者有放射性損傷，且檢查結(jié)果會(huì)受判斷者的主觀因素影響。因此，尋找靈敏、便捷的診斷靶標(biāo)以實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)雖不是血液循環(huán)中唯一的腫瘤衍生物，但它們包含一群轉(zhuǎn)移性前體[2-3]，對(duì)疾病進(jìn)展至關(guān)重要，可提供癌癥生物學(xué)的信息，用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，并有可能用于指導(dǎo)個(gè)性化的癌癥治療。目前，CTCs的研究主要集中在方法學(xué)開發(fā)階段，如膜過濾法[4]、免疫磁珠法[5]、基于物理或生物特性和免疫細(xì)胞化學(xué)法的微流控芯片技術(shù)[6-7]和流式細(xì)胞術(shù)等，尚未進(jìn)行廣泛的臨床應(yīng)用，其應(yīng)用價(jià)值仍在探索中。有研究報(bào)道，可將免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交術(shù)(imFISH)在臨床上應(yīng)用于各種惡性腫瘤CTCs的檢測(cè)，但以往的研究大多僅聚焦于其在單一惡性腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值[8-9]。本研究采用imFISH CTCs檢測(cè)技術(shù)，考察了多種常見惡性腫瘤患者的外周血CTCs陽(yáng)性率，分析了CTCs陽(yáng)性率與臨床分期、病灶最大徑、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及與常見腫瘤標(biāo)志物之間的關(guān)系，旨在探討CTCs檢測(cè)在多種惡性腫瘤診斷及預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年6月至2020年11月于深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)羅湖區(qū)人民醫(yī)院就診的惡性腫瘤患者的臨床資料，包括CTCs檢測(cè)結(jié)果、臨床病理資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等。納入經(jīng)病理活檢證實(shí)且有明確病史資料的惡性腫瘤患者共235例，其中乳腺癌80例、肺癌53例、結(jié)直腸癌31例、心臟肉瘤14例、胃癌12例、子宮內(nèi)膜癌12例、肝癌7例、食管癌7例、輸尿管惡性腫瘤6例、宮頸癌5例、胰腺癌5例、前列腺癌2例、腎細(xì)胞癌1例?；颊咧形荒挲g56歲，年齡范圍28～85歲；男107例、女128例。外周血標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)包括未接受治療(外科手術(shù)、放化療、新輔助治療等)、術(shù)后化療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移期。

1.2儀器與試劑 包括ACD保養(yǎng)管(美國(guó)BD公司)、低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、雜交儀(Dako公司)、Cyttel?染色體擴(kuò)增型CTCs檢測(cè)系統(tǒng)(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司，采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合imFISH檢測(cè)技術(shù))。

1.3方法

1.3.1CTCs陰性富集 足量采集外周血至ACD保養(yǎng)管(5 mL)2管(其中1支用于復(fù)查)。采血完畢后立即輕輕顛倒混勻8次，24 h內(nèi)于室溫(15～30 ℃)進(jìn)行CTCs陰性富集。嚴(yán)格參考說明書進(jìn)行操作，主要步驟：(1)以600×g離心5 min，分離并去除血漿；(2)將紅細(xì)胞裂解液加至標(biāo)本中，混勻，裂解紅細(xì)胞8 min后以600×g離心5 min，收集沉淀的細(xì)胞團(tuán)；(3)在收集的細(xì)胞團(tuán)中加入100 μL免疫磁微粒，室溫振蕩孵育20 min，去除白細(xì)胞；(4)磁吸附，收集細(xì)胞懸液，涂于玻片固定并干燥。

1.3.2imFISH檢測(cè) 在制備好的玻片標(biāo)本上滴加CEP8探針10 μL，于雜交儀中變性(75 ℃，5 min)、雜交(37 ℃，1.5 h)。滴加抗CD45抗體孵育1 h后，加DAPI染核，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3鑒定與判讀 將CEP8+CD45-DAPI+的細(xì)胞計(jì)為CTCs(CEP8熒光探針信號(hào)點(diǎn)≥3個(gè))，健康人CTCs計(jì)數(shù)的參考范圍為0～1個(gè)/3.2 mL，CTCs≥2個(gè)/3.2 mL的患者為CTCs陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism軟件繪制數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié) 果

2.1惡性腫瘤患者CTCs陽(yáng)性率 惡性腫瘤患者CTCs總陽(yáng)性率為65.53%(154/235)。在235例惡性腫瘤患者中，未接受相關(guān)治療患者48例，其CTCs陽(yáng)性率為54.17%(26/48)，與術(shù)后化療患者CTCs陽(yáng)性率[61.79%(76/123)]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.833，P=0.361)。經(jīng)CT檢查確診為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者有64例，CTCs陽(yáng)性率為81.25%(52/64)。不同類型惡性腫瘤患者CTCs檢測(cè)結(jié)果：乳腺癌患者CTCs陽(yáng)性率為41.25%(33/80)，肺癌患者CTCs陽(yáng)性率為73.58%(39/53)，兩者CTCs陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.425，P<0.05)。由于其他癌種的病例數(shù)較少，故未納入統(tǒng)計(jì)。乳腺癌與肺癌患者中未接受相關(guān)治療、術(shù)后化療和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的3類患者CTCs陽(yáng)性率見圖1。

圖1 乳腺癌和肺癌CTCs陽(yáng)性率變化

2.2CTCs與腫瘤臨床特征的關(guān)系 不同臨床分期患者CTCs陽(yáng)性率：Ⅰ～Ⅱ期患者陽(yáng)性率最低，為38.37%；Ⅲ期患者CTCs陽(yáng)性率為69.49%；Ⅳ期患者CTCs陽(yáng)性率最高，為88.89%；Ⅰ～Ⅱ期與Ⅳ期患者CTCs陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.232，P<0.05)。CTCs計(jì)數(shù)最多(12個(gè)/3.2 mL)的患者病灶最大徑>5 cm，有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，臨床分期為Ⅳ期。CTCs陽(yáng)性率與臨床分期、病灶最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 CTCs與235例惡性腫瘤患者的臨床分期、80例乳腺癌分子分型的關(guān)系

2.3血清腫瘤標(biāo)志物水平與CTCs陽(yáng)性率的關(guān)系 不同癌胚抗原(CEA)和糖類抗原(CA)153水平的乳腺癌患者CTCs陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同CEA、CA125、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、細(xì)胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和鐵蛋白水平的肺癌患者CTCs陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CTCs陽(yáng)性與乳腺癌和肺癌常見腫瘤標(biāo)志物之間的關(guān)系

2.4動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)6例惡性腫瘤患者的CTCs計(jì)數(shù) 選取CTCs連續(xù)監(jiān)測(cè)4次以上且臨床分期處于Ⅱ期以上的6例常見惡性腫瘤患者，以CTCs核形變化情況將其分為核體積變化穩(wěn)定組和核體積變化波動(dòng)組進(jìn)行觀察，觀察患者CTCs計(jì)數(shù)、核形態(tài)變化情況、疾病進(jìn)展情況、治療反應(yīng)。(1)CTCs核體積變化穩(wěn)定組?；颊?為肺腺癌患者，監(jiān)測(cè)過程中，共檢出CTCs 3次；第1次CTCs核體積大，后兩次核體積較?。辉摶颊咝凶蠓蜗侔┬g(shù)后化療，CTCs從6個(gè)/3.2 mL降至3個(gè)/3.2 mL，2個(gè)月后降為1個(gè)/3.2 mL，；疾病緩解，接受靶向治療，預(yù)后良好?；颊?為子宮內(nèi)膜癌患者，在監(jiān)測(cè)過程中，共檢出CTCs 8次；該患者子宮內(nèi)膜癌術(shù)后接受放療并行輔助化療，CTCs檢測(cè)顯示核體積較小，數(shù)量增加，1年后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，CTCs增加至7個(gè)/3.2 mL；行腫瘤免疫治療后CTCs降至1個(gè)/3.2 mL，提示預(yù)后良好，免疫治療效果有效?；颊?為乳腺癌患者，監(jiān)測(cè)過程中，共檢出CTCs 2次，核體積基本無(wú)變化；該患者左乳癌術(shù)后行內(nèi)分泌治療，CTCs為2個(gè)/3.2 mL；隨著治療的進(jìn)行，CTCs降至0，患者預(yù)后良好。見圖3。(2)CTCs核體積變化波動(dòng)組?；颊?為升結(jié)腸中分化腺癌患者，連續(xù)9次監(jiān)測(cè)均檢出CTCs；該患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，CTCs核體積大，連續(xù)6次CTCs監(jiān)測(cè)，核體積變化明顯，行姑息性化療后CTCs核體積先減小后增大，最后患者死亡?；颊?為右肺上葉中低分化鱗狀細(xì)胞癌患者，連續(xù)13次監(jiān)測(cè)，均檢出CTCs；該患者確診后，未行手術(shù)切除，CTCs核體積較大；3個(gè)月后體積減小，CTCs計(jì)數(shù)降低至2個(gè)/3.2 mL，但2個(gè)月后CTCs計(jì)數(shù)增加至4個(gè)/3.2 mL，該患者疾病進(jìn)展，接受腫瘤免疫治療。患者6為胃癌術(shù)后多發(fā)肝轉(zhuǎn)移，連續(xù)8次監(jiān)測(cè)，均檢出CTCs，核體積隨疾病進(jìn)展變化頻率增大；該患者行化療后，CTCs計(jì)數(shù)均≥4個(gè)/3.2 mL，3個(gè)月后CTCs達(dá)到12個(gè)/3.2 mL，最后患者死亡。

注：患者1為結(jié)腸癌患者；患者2、3為肺癌患者；患者4為子宮內(nèi)膜癌患者；患者5為乳腺癌患者；患者6為胃癌患者。

3 討 論

惡性腫瘤的早期、伴隨診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)一直是臨床關(guān)注焦點(diǎn)，隨著CTCs檢測(cè)技術(shù)從科研走向臨床，CTCs檢測(cè)取材便捷、易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和有助于預(yù)后評(píng)估的特點(diǎn)使其在臨床中的應(yīng)用受到關(guān)注。本研究中，imFISH CTCs檢測(cè)多類惡性腫瘤的總陽(yáng)性率為65.53%，與趙振坤等[10]報(bào)道相近(CTCs陽(yáng)性率為76.6%)。CTCs檢測(cè)技術(shù)最早應(yīng)用于乳腺癌的檢測(cè)，因此相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多，然而王瑞娟等[11]報(bào)道乳腺癌CTCs陽(yáng)性率不高(陽(yáng)性率為55.56%)，與本研究結(jié)果相似(陽(yáng)性率僅為41.25%)，而與LOEIAN等[12]運(yùn)用納米管-CTCs芯片檢測(cè)Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌CTCs陽(yáng)性率為100.0%的結(jié)果有明顯差異。上述結(jié)果提示，CTCs陽(yáng)性率與檢測(cè)方法密切相關(guān)，本研究采用的CTCs陰性富集法聯(lián)合8號(hào)染色體拷貝數(shù)變異的imFISH方法在乳腺癌中的診斷靈敏度可能還有待提高。本研究中，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者CTCs陽(yáng)性率為81.25%，與未接受相關(guān)治療和術(shù)后化療患者有明顯差異，這表明CTCs檢測(cè)有助于監(jiān)測(cè)癌癥患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這可能與CTCs在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和CTCs具備腫瘤干細(xì)胞的特性有關(guān)[13]。

本研究中，CTCs與病灶最大徑、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致[14-15]。雖然臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者CTCs陽(yáng)性率(38.37%)低于Ⅳ期(88.89%)，但這也表明早期惡性腫瘤患者外周血即已存在CTCs，隨著疾病的惡化，CTCs陽(yáng)性率升高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者其CTCs陽(yáng)性率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，這表明若CTCs數(shù)量增多則提示腫瘤存在轉(zhuǎn)移的可能性。此外，本研究分析了80例乳腺癌患者CTCs的存在與乳腺癌Her-2分型及三陰性乳腺癌的關(guān)系，結(jié)果顯示CTCs的陽(yáng)性率在Her-2陰性與Her-2陽(yáng)性乳腺癌之間無(wú)明顯差異，在三陰型與非三陰型乳腺癌間也無(wú)明顯差異，與張娜賢等[16]等運(yùn)用imFISH檢測(cè)CTCs所得到的結(jié)果相同，提示imFISH CTCs檢測(cè)尚不能區(qū)分不同乳腺癌分型。

血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)雖在特異度和敏感度方面欠佳，但因其檢測(cè)簡(jiǎn)便，已作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目用于惡性腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等。本研究分析了乳腺癌和肺癌的CTCs陽(yáng)性率與常見腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA125、CA153、NSE、CYFRA21-1和鐵蛋白)檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系，結(jié)果表明CTCs與上述腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果均無(wú)相關(guān)性。乳腺癌中的結(jié)果與趙振坤等[10]的報(bào)道相同，而肺癌中的結(jié)果與TAN等[17]的報(bào)道不相同(該研究認(rèn)為肺癌患者CTCs與CEA、CA125、CA153檢測(cè)結(jié)果存在一定相關(guān)性)，與ZHENG等[18]的報(bào)道也不相同(該研究認(rèn)為CTCs與CEA的檢測(cè)結(jié)果有相關(guān)性，并將兩者的檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用于指導(dǎo)肺癌患者治療)。本研究表明，CTCs作為惡性腫瘤患者綜合監(jiān)測(cè)的指標(biāo)可能優(yōu)于現(xiàn)有的常見血清腫瘤標(biāo)志物，但要還需進(jìn)一步進(jìn)行大樣本量的統(tǒng)計(jì)分析。

本研究使用的CTCs檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞的大小、形態(tài)無(wú)影響，因此分析了6例連續(xù)檢測(cè)CTCs的惡性腫瘤患者。結(jié)果顯示，終點(diǎn)事件為預(yù)后不良或死亡的患者，即使在治療期間其CTCs細(xì)胞核體積變化也無(wú)規(guī)律，大小變化頻繁，且CTCs計(jì)數(shù)也變化不定；而預(yù)后良好者，在治療期間CTCs細(xì)胞核體積變化大多為減小(患者5雖然2次檢出CTCs細(xì)胞核體積無(wú)明顯改變，但這可能與兩次檢測(cè)間期短且檢測(cè)次數(shù)少有關(guān)；患者4發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)，CTCs細(xì)胞核體積稍有增大且CTCs計(jì)數(shù)增加，但隨治療的繼續(xù)進(jìn)行，CTCs數(shù)量降為2個(gè)/3.2 mL以下)。本研究表明，CTCs細(xì)胞核體積變化規(guī)律及檢出數(shù)量可以預(yù)測(cè)腫瘤患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，尤其可作為預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一。

本研究不足之處在于納入研究的各類惡性腫瘤臨床病例樣本量不夠大。本研究表明，CTCs的陽(yáng)性率可能為惡性腫瘤患者的臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)提供參考，CTCs的數(shù)量和細(xì)胞核體積可能成為評(píng)估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、治療效果及預(yù)后判斷的指標(biāo)。