乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭患者外周血miR-200a、miR-451a水平及臨床意義

朱 江，李海淵，董海英

河北省秦皇島市第二醫(yī)院，河北秦皇島 066600

慢加急性肝衰竭(ACLF)作為一種嚴重肝臟損傷，臨床主要表現(xiàn)為凝血功能障礙與黃疸，并伴有腹水、肝性腦病等并發(fā)癥，發(fā)病急驟，病死率較高[1-3]。ACLF病理基礎可能是肝硬化，也可能是無肝硬化的慢性肝病，我國ACLF最常見病因為乙型肝炎病毒(HBV)感染，被稱為乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)[4-5]。HBV-ACLF預后較差，調(diào)查顯示其28 d病死率為其他慢性肝病的15倍[6]，因此迫切需要篩選出生物學標志物用于診斷HBV-ACLF及評估HBV-ACLF患者預后，為治療方案制訂提供依據(jù)。循環(huán)中微小RNA(miRNA)可在血清中穩(wěn)定存在，不僅可作為多種疾病的診斷標志物，還可作為疾病預后評估的新指標、治療的新靶標[7-8]。目前，已有相關研究指出，miR-200a、miR-451a在HBV-ACLF患者血清中水平異常[9-10]，但未對HBV-ACLF患者miR-200a、miR-451a水平改變的臨床意義進行更加深入的探討?；诖耍狙芯繖z測了HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平，并進一步探討了其臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年7月至2021年3月收治的60例HBV-ACLF患者作為觀察組，男34例、女26例，年齡45～78歲、平均(61.54±8.25)歲。另選取同期本院收治的60例慢性乙型肝炎(CHB)患者作為對照組，男31例、女29例，年齡44～76歲、平均(31.15±9.26)歲。兩組年齡、性別等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核批準，倫理批號：QEYLL(醫(yī))2019001001?；颊呒捌浼覍倬鶎Ρ狙芯恐橥?。納入標準：CHB的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中相關診斷標準[11]；HBV-ACLF的診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》中相關診斷標準[12]，并自愿簽署同意書。排除標準：患其他病毒性肝炎；伴有結(jié)締組織疾??；合并惡性腫瘤；既往有酒精性肝病、自身免疫性肝病；納入研究前3個月內(nèi)接受了糖皮質(zhì)激素治療。根據(jù)1個月的短期預后情況又將觀察組的HBV-ACLF患者分為死亡組(15例)和生存組(45例)。

1.2方法 納入研究的患者均于入院第2天清晨空腹狀態(tài)下采集2管5 mL靜脈血。一管于4 ℃環(huán)境下，以3 000 r/min離心處理15 min，分離血清，置于-80 ℃儲存待檢，采用日本AU2700型全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平，以實時熒光定量PCR測定HBV-DNA水平。另一管室溫下靜置30 min后，以1 500 r/min離心處理20 min，分離血清，置于-80 ℃下待檢；采用Trizol提取外周血總RNA，以紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?，采用實時熒光定量PCR檢測外周血miR-200a、miR-451a水平，引物由廣州銳博生物工程有限公司合成，采用2-ΔΔCT法對外周血miR-200a、miR-451a的相對水平進行定量分析。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關進行相關性分析；采用Logistic回歸進行影響因素分析；預測價值分析采用受試者工作特征(ROC)曲線，獲取曲線下面積(AUC)、置信區(qū)間、靈敏度、特異度及截斷值，對兩項指標聯(lián)合檢測實施Logistic二元回歸擬合，返回預測概率Logit(P)，將其作為獨立檢驗變量。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血miR-200a、miR-451a水平比較 觀察組外周血miR-200a水平高于對照組，miR-451a水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血miR-200a、miR-451a水平比較

2.2兩組相關生化指標水平比較 觀察組ALT、AST、TBIL水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組ALB、HDL-C、LDL-C、TC、TG及HBV-DNA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組相關生化指標水平比較

組別nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HBV-DNA(lg copy/mL)觀察組601.65±0.323.33±0.353.50±0.571.59±0.575.37±0.77對照組601.69±0.273.35±0.593.54±0.601.81±0.695.27±0.64t0.7400.2260.3741.9040.774P0.4610.8220.7090.0590.441

2.3外周血miR-200a、miR-451a水平與相關生化指標的相關性分析 Pearson相關性分析表明，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平與ALT、AST、TBIL水平呈正相關(r=0.597、0.598、0.584，P<0.05)，miR-451a與ALT、AST、TBIL水平呈負相關關系(r=-0.607、-0.613、-0.592，P<0.05)。HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平與ALB、HDL-C、LDL-C、TC、TG及HBV-DNA均無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 外周血miR-200a、miR-451a水平與相關生化指標相關性分析

2.4外周血miR-200a、miR-451a水平對HBV-ACLF的診斷價值 以觀察組作為陽性樣本，對照組作為陰性樣本，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，外周血miR-200a、miR-451a水平用于診斷HBV-ACLF的AUC分別為0.832、0.777，將miR-200a、miR-451a經(jīng)Logistic回歸模型擬合生成聯(lián)合預測因子，列出聯(lián)合預測因子取不同值時對應的靈敏度、特異度和預測準確率，取約登指數(shù)為最大值時聯(lián)合預測因子所對應的數(shù)值作為最佳截斷值，AUC為0.925，較各檢測指標單獨診斷的效能更高。見表4、圖1。

表4 外周血miR-200a、miR-451a水平單獨及聯(lián)合診斷對HBV-ACLF的診斷效能

圖1 外周血miR-200a、miR-451a水平用于HBV-ACLF診斷的ROC曲線

2.5不同預后的HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平比較 HBV-ACLF患者中，死亡組外周血miR-200a水平高于生存組，miR-451a水平低于生存組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同預后HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平比較

2.6外周血miR-200a、miR-451a水平與HBV-ACLF患者預后的關系 以預后情況為因變量(生存=0，病死=1)，外周血miR-200a、miR-451a水平作為自變量(以ROC曲線獲得的截斷值為界：≤截斷值=1，>截斷值=2)，經(jīng)Logistic回歸分析，外周血miR-200a、miR-451a水平均為HBV-ACLF患者死亡的獨立影響因素(P<0.05)，miR-200a水平越高、miR-451a越低，患者死亡風險越大(P<0.05)。見表6。

表6 外周血miR-200a、miR-451a水平與HBV-ACLF患者預后的關系

3 討 論

HBV作為一種嗜肝病毒，主要存在于肝細胞內(nèi)，損傷肝細胞，引起肝細胞炎癥、壞死，纖維化[13]。在我國，HBV是引起肝衰竭的重要原因之一。HBV-ACLF主要發(fā)生于既往存在HBV感染患者，當其受感染、勞累等因素影響時，急劇發(fā)生嚴重肝功能不全，發(fā)病急驟，病情進展迅速，病死率高達50%以上[14-15]。因此，及早診斷HBV-ACLF尤為關鍵。

miRNA是一類具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯等重要功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過與目標信使RNA特異性結(jié)合，降解靶RNA或抑制靶RNA翻譯，或在特定條件下上調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達[16-17]。miRNA參與調(diào)控機體多種生物學過程，單個miRNA可參與多個信號通路的調(diào)節(jié)，而同一個信號通路也可受多種miRNA調(diào)節(jié)，由此構(gòu)成一個復雜的miRNA信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)。miRNA異常表達與人類癌癥、病毒感染、炎癥及心血管疾病等多種疾病發(fā)生與發(fā)展有關。miR-200a、miR-451a不僅在CHB診斷中具有重要意義，在肝臟的生理代謝及肝病致病機制中也被廣泛研究。

以往研究顯示，miR-200a在肝癌患者中異常表達，參與了肝癌發(fā)生，對肝癌診斷具有一定價值[18]。有學者通過微陣列分析技術(shù)，篩選出許多miRNA，發(fā)現(xiàn)在HBV-ACLF患者中有9種miRNA表達上調(diào)，包括miR-200a[19]。本研究中，觀察組外周血miR-200a水平明顯高于對照組(P<0.05)，與上述結(jié)果一致，且ROC曲線顯示，其診斷HBV-ACLF的AUC為0.832，具有一定診斷效能，提示HBV-ACLF患者血液中存在miR-200a高水平，臨床可通過檢測其水平為疾病診斷提供參考，說明miR-200a不僅是一個體現(xiàn)肝脂肪變性的階段性標志物，同時也是肝細胞損傷的預測因子。進一步研究顯示，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平與肝功能指標ALT、AST、TBIL水平呈正相關(P<0.05)，且30 d病死患者外周血miR-200a水平高于生存患者(P<0.05)，提示隨HBV-ACLF患者病情發(fā)展，肝細胞損傷加重，外周血miR-200a水平明顯上調(diào)，miR-200a可預測患者預后。

一項CHB患者miRNA診斷標志物及其與HBV復制的相關性研究中發(fā)現(xiàn)，相較于健康人，CHB患者血液中miR-451a水平明顯下降，選擇miR-451a進行ROC曲線分析，AUC達到0.882，特異度及靈敏度均在80%以上，具有一定診斷價值[20]。另有研究指出，miR-451a可通過結(jié)合3′UTR抑制肝臟中致癌因子水平，同時還可抑制肝癌細胞遷移，是優(yōu)良的抑癌miRNA，在肝癌治療中具有潛在應用價值[21]。本研究對比分析了CHB患者與HBV-ACLF患者miR-451a水平，發(fā)現(xiàn)后者外周血miR-451a水平明顯下調(diào)，分析原因，可能是由于miR-451a通過影響肝細胞膜相關細胞因子水平，進而緩解肝臟纖維化，防止肝衰竭。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451a可用于診斷HBV-ACLF，且其水平與患者肝功能指標呈負相關(P<0.05)，是患者1個月短期預后的獨立影響因素(P<0.05)，提示miR-451a在HBV-ACLF發(fā)生、病情演變過程中發(fā)揮重要作用。此外，本研究中miR-200a、miR-451a聯(lián)合診斷HBV-ACLF的AUC為0.925，較單個指標診斷的效能明顯提高，因此，建議臨床可同時檢測二者水平。

綜上所述，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平上調(diào)，miR-451a水平下調(diào)，且二者水平與肝功能及預后有關，可為臨床診斷及預后評估提供參考。