基于全基因組和轉(zhuǎn)錄組的綠豆谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因及其對鎘脅迫的響應(yīng)

張創(chuàng)娟程 斌楊 樂冷 艷李師翁

(蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,蘭州 730070)

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST,EC 2.5.1.1.8)廣泛分布于真核生物與原核生物,該酶蛋白含有1個(gè)N 端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域,N 端包括谷胱甘肽結(jié)合和催化殘基,而相對保守的C 端主要由5～6個(gè)螺旋組成,結(jié)合疏水底物并決定GST 的特異性和活性[1]?；诿庖呓徊娣磻?yīng)性、蛋白質(zhì)序列相似性、基因結(jié)構(gòu)、底物特異性和特定殘基的保守性,可將植物GST 分為14類:Phi(F)、Tau(U)、Theta(T)[2]、Zeta(Z)、Lambda(L)、谷胱甘肽依賴性脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)[3]、Metaxins、Hemerythrin(H)、Iota(I)[4]、四氯對苯二酚脫氫鹵化酶(TCHQD)、真核翻譯延伸因子1B的γ-亞基類(EF1Bγ)、谷胱甘肽氫醌還原酶(GHRs)、含兩種硫氧還蛋白的 GSTs(GST2N)、微粒體前列腺素E合成酶2型(mPGES2)[5]。其中Tau、Phi、Zeta、Theta和TCHQD都含有1 個(gè)具有催化功能的絲氨酸,Iota、Hemerythrin、DHAR、Lambda、GHRs、m PGES2 和Metaxins類在活性位點(diǎn)的基序中有1 個(gè)非常保守的半胱氨酸。Tau、Phi、DHAR 和Lambda四類是植物所特有的,且Tau和Phi類在植物中含量最豐富。DHAR 和Lambda類是單體,對外源底物沒有谷胱甘肽結(jié)合活性,在氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[6-7]。Iota類僅在非維管植物、藻類和藍(lán)藻中被鑒定,似乎在大多數(shù)陸生植物的進(jìn)化過程中丟失了[4,7]。GST 基因(GST)家族在多種植物中都有研究,例如,甘藍(lán)型油菜基因組含有83個(gè)GSTs,44.2%在不同的染色體上,47.6%的重復(fù)GSTs具有不同的表達(dá)模式[8]。蘿卜中鑒定出82個(gè)GSTs,分為Tau、Pfhi、Theta、Zeta、Lambda、TCHQD 和DHAR 7類[9]。研究表明,GST 通過催化谷胱甘肽(GSH)的硫醇基團(tuán)和親電基團(tuán)在疏水和有毒底物中的S偶聯(lián),保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)誘導(dǎo)的毒性,并提高其耐受性[10]。鹽、寒、旱和ABA(脫落酸)處理均導(dǎo)致煙草GST 表達(dá)上調(diào)[11]。過氧化氫、銅、砷、鎘和鋅脅迫下,甘薯地上組織中IbGSTU19表達(dá)下調(diào),IbGSTU5、IbGSTU3和Ib GSTU12表達(dá)上調(diào);而在地下組織中,Ib GSTU24、Ib GSTU27 和Ib GSTU16 表 達(dá) 上調(diào)[12]。近年來,GST 在植物響應(yīng)重金屬Cd脅迫中的作用受到廣泛關(guān)注。例如,Cd和Ni顯著提高小麥幼苗芽和根中GST 活性[13],200 mg/L Cd暴露72 h 和96 h 增加大豆GST 活性[14],白菜BcGSTUs的表達(dá)受到Cd的誘導(dǎo)[15]。綠豆[Vigna radiata(L.)R.Wilczek]是世界范圍內(nèi)廣泛種植的豆科作物,主要分布在南亞和東南亞、非洲、南美和澳大利亞[16]。前期的研究發(fā)現(xiàn),Cd脅迫強(qiáng)烈上調(diào)綠豆根中GSTs[17],但對于綠豆GSTs及其編碼蛋白的特征和功能尚不清楚。為此,本研究運(yùn)用基因組學(xué)方法分析綠豆GST 家族成員及其編碼蛋白,并與擬南芥和大豆進(jìn)行比較;運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析綠豆GST 在根、莖、葉中的表達(dá)譜及其對Cd脅迫的響應(yīng);最后,分析Cd脅迫對根、莖、葉中GST 酶活性的影響。本研究結(jié)果為植物GST 及其功能研究和綠豆GST 的基因工程應(yīng)用提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)與處理

新鮮綠豆[Vigna radiata(L.)R.Wilczek]種子用蒸餾水沖洗后用75%乙醇浸泡15 min,無菌水沖洗,于(25±1)℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h,播種于蛭石和珍珠巖基質(zhì)(1∶1)的育苗盤中,每盤不少于20株。對照組以1/2 Hogland營養(yǎng)液澆灌,處理組以濃度100μmol/L Cd Cl2·6 H2O 的1/2 Hogland營養(yǎng)液澆灌,每組至少種植3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)[17]。將育苗盤置于25 ℃、光強(qiáng)度為2 500 lx、光周期為14/10 h(光照/黑暗)的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在無菌條件下,于培養(yǎng)的第1、5、9天分別取根、莖、葉于液氮迅速冷凍,置于-80 ℃冰箱儲存用于RNA提取。于培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天分別取根、莖、葉用于GST酶活測定。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序與基因表達(dá)分析

用RNA 提取試劑盒(SK8631,上海生工生物)按操作說明進(jìn)行總RNA 提取,所得總RNA溶解于50μL無RNA 酶的水中,于-80 ℃冰箱儲存。用安捷倫2100 生物分析儀和NanoDrop ND-1 000 分光光度計(jì)評估RNA 質(zhì)量和濃度,RIN 值為8.1～9.9,OD260/280為1.8～2.2。用Truseq TM RNA(Illumina)試劑盒純化m RNA,Truseq TM DNA(Illumina)試劑盒構(gòu)建cDNA 文庫,用安捷倫2100 生物分析儀檢測cDNA 文庫的質(zhì)量。文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

轉(zhuǎn)錄組測序得到的raw reads,用軟件FastQC V0.10.1設(shè)置ASCII Q-score偏移量為33進(jìn)行質(zhì)量評估,使用軟件HISAT2(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)將產(chǎn)生的clean reads 與綠豆基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term =Vigna radiata)進(jìn)行比對,使用軟件String Tie(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)將比對的reads組裝為轉(zhuǎn)錄本,軟件RSEM 對基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,表達(dá)量的結(jié)果以TPM(transcripts per kilobase per million mapped reads)值表示,利用軟件DESeq2進(jìn)行樣品間基因差異表達(dá)分析,設(shè)置參FDR<0.05,|log2FC|≥1,符合標(biāo)準(zhǔn)的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因(DEGs)。

1.3 GST酶活分析

0.5 g 植物材料,液氮研磨,加3 m L 0.2 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(含1 mmol/L Na2-EDTA,5 mmol/L DTT,p H 7.8)研磨成勻漿,倒入預(yù)冷離心管中,用1 m L 緩沖液沖洗研缽一并倒入離心管,于4 ℃12 500 r/min 離心15 min,上清液為粗酶液。酶反應(yīng)體系為2.7 m L 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L Na2-EDTA,p H 6.5),0.1 m L 30 mmol/L 的GSH,50 μL 粗 酶 液,然 后 加 入0.1 m L 30 mmol/L 的1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)啟動反應(yīng),以不加CDNB的空白管為對照,測定OD340,計(jì)算酶活(U/g),1 U=1μmol/min,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 綠豆GST基因鑒定及特征分析

分別從TAIR(https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/gst.jsp)數(shù)據(jù)庫和Legume Information System (LIS,https://legumeinfo.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索擬南芥和大豆GST 序列,通過NCBI的BLASTN 比對(E-value<10-10)和綠豆全基因組數(shù)據(jù)檢索,獲得候選的綠豆GSTs,NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確定其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有典型的GST_N 和GST_C 結(jié)構(gòu)域[18],確定綠豆GST 家族成員,采用綠豆拉丁名首字母縮寫“Vr”為前綴,后接GST 和分類簡寫,最后接唯一編號進(jìn)行命名,例如VrGSTF1。

用MEGA 7.0軟件的Clustal W 鄰接法構(gòu)建綠豆GST 氨基酸序列系統(tǒng)樹,獲得Newick樹文件,使用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)進(jìn)行GST 蛋白序列的保守motif分析,motif的數(shù)量設(shè)置為10,分析結(jié)果以XML 文件輸出,將獲得的Newick 樹文件、XML 文件和基因組注釋文件通過Tbtools軟件可視化。

1.5 綠豆GST蛋白特征分析

用ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件預(yù)測GSTs的理化性質(zhì),包括分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和氨基酸組成等[19]。在Wo LFPSORTⅡ(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù) 測GST 亞 細(xì) 胞定位。Pfam Search(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)分析GST 結(jié)構(gòu)域,分析結(jié)果用Tbtools軟件可視化。

1.6 GSTs系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ClustalW 進(jìn)行擬南芥、大豆及綠豆GSTs比對[20],使用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap設(shè)置為1 000[21],并使用iTOL在線軟件(https://itol.embl.de/itol.cgi)可視化[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對綠豆幼苗生長的影響

形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析表明,100μmol/L CdCl2脅迫顯著抑制綠豆幼苗的生長(表1),導(dǎo)致株高降低4.4%,根長降低10.4%,側(cè)根數(shù)減少28.4%,莖葉鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別減少16.4%和16.3%,根鮮質(zhì)量減少16.5%。表明Cd嚴(yán)重影響根伸長和側(cè)根生長,而對根干質(zhì)量無影響,這可能與根吸收和積累了過量Cd有關(guān)。

表1 Cd脅迫綠豆幼苗形態(tài)指標(biāo)(±s)Table 1 Morphological parameters of mung bean seedlings under Cd stress

表1 Cd脅迫綠豆幼苗形態(tài)指標(biāo)(±s)Table 1 Morphological parameters of mung bean seedlings under Cd stress

樣本Samples株高/mm Plant height根長/mm Root length側(cè)根數(shù)Lateral root No.莖葉鮮質(zhì)量/g Shoot fresh mass莖葉干質(zhì)量/g Shoot dry mass根鮮質(zhì)量/g Root fresh mass根干質(zhì)量/g Root dry mass CK 181.75±3.46 a 135.53±11.40 a 29.18±2.13 a 305.67±12.25 a 30.0±0.5 a 172.33±13.59 a 8.11±0.73 a 100μmol/L CdCl2 173.62±3.19 b 121.38±3.43 a 20.9±1.19 b 255.57±11.78 b 25.1±0.29 b 143.88±4.08 b 8.13±0.51 a

2.2 綠豆GST基因及其結(jié)構(gòu)特征

從TAIR 和LIS數(shù)據(jù)庫中檢索到53個(gè)擬南芥和100 個(gè)大豆GST 蛋白序列,通過BLASTN比對和全基因組數(shù)據(jù)檢索,獲得候選基因,然后通過NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(CDD)用來識別基因編碼蛋白質(zhì)中典型的GST_N 和GST_C結(jié)構(gòu)域,最終鑒定出93個(gè)綠豆GST 家族成員,將其命名為Vr GSTs,包括Tau、Phi、Lambda、Theta、Zeta、DHAR、EF1Bg、GHRs、mPGES2 和TCHQD10類,其分類命名見表2。其中屬于Tau 類和Phi類GSTs最多,分別為38和12個(gè)。

在系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖1),Tau類為一大分支,各亞類在進(jìn)化關(guān)系上最近,聚集在同一小的分支。保守基序分析結(jié)果表明,Vr GSTs在motif數(shù)目和種類上差異較大,Motif 2幾乎是所有基因共有的,存在于91%的基因;同一分類motif分布具有相似性,如Tau類都含有motif(1-6),Phi類都含有motif 2、motif 4和motif 9,GHRs類具有完全相同的motif分布?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,不同類Vr GSTs在結(jié)構(gòu)上具有較大差異,同一分類Vr GSTs 結(jié) 構(gòu) 高 度 相 似;除Vr GSTF7、Vr GSTF8、Vr GSTL1 沒有內(nèi)含子外,其余基因都有2～3個(gè)內(nèi)含子,外顯子數(shù)目在2～10個(gè)不等(圖1-c),Tau 類 和TCHQD 類 都 含 有2 個(gè) 外 顯 子,Phi類除VrGSTF1 和Vr GSTF7 外都含有3 個(gè)外顯子,GHRs類有5 個(gè),Lambda、Theta、Zeta、DHAR、EF1Bg 和mPGES2 有 較 多 的 外 顯 子(6～10個(gè))。

圖1 綠豆GST親緣關(guān)系(a)、保守motif(b)和基因結(jié)構(gòu)(c)Fig.1 Phylogenetic relationship(a),conserved motif(b)and structure of mung bean GSTs(c)

2.3 綠豆GST蛋白結(jié)構(gòu)及特征

ProtParam tool軟件對綠豆GST 的理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果見表2。綠豆GSTs 的氨基酸數(shù)目為107(Vr GSTF7)～ 420(Vr EF1Bg1、Vr EF1Bg2),Vr GSTF7、VrGSTL4、Vr GSTZ4-3和Vr GSTZ4-8少于200,Vr EF1Bg1-3、m PGES1-2 和GHRs 類 多 于300 個(gè) 氨 基 酸 外,其 余(84.2%)氨基酸數(shù)目均在200～300。分子質(zhì)量介于12.42～47.93 ku,分子質(zhì)量最小的為氨基酸數(shù)目最少的Vr GSTF7,分子質(zhì)量最大的為Vr EF1Bg3,GHRs和mPGES2類分子質(zhì)量也比較高,最高分別為42.19 和40.19 ku,大多(70.5%)集中在20～30 ku。等電點(diǎn)的范圍為4.52～9.67,其中Theta、m PGES2和TCHQD 類的等電點(diǎn)都大于8,Vr GSTU10、Vr GSTU14、Vr GSTF1、Vr GSTF 7、Vr GSTF 8和Vr DHAR 2的等電點(diǎn)大于7,分別為7.87、8.38、7.69、8.01、7.68和8.62,其余(77.89%)的蛋白的等電點(diǎn)都在4.52～6.82內(nèi),大多數(shù)都為酸性蛋白。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明Vr GSTs分布于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核、線粒體及過氧化物酶體,但主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,其中Vr GSTT2、Vr GSTF10、VrGSTF11、VrmPGES2定位于線粒體中,Vr GSTU1、Vr GSTL1等19個(gè)定位于葉綠體。

表2 綠豆GST蛋白特性Table 2 Characteristics of the GST protein of mung bean

(續(xù)表2 Continued table 2)

對 Vr GST 結(jié)構(gòu)域分析表明(圖2),Vr DHAR2、Vr GSTL2-1、Vr GSTL2-4 和Vr GSTL4只含有GST_N 端結(jié)構(gòu)域,Vr GSTF7 和Vr GSTF8只含有GST_C 端結(jié)構(gòu)域,其余Vr GSTs都含有GST_N 和GST_C 結(jié)構(gòu)域。Tau類都具有GST_N_Tau和GST_C_Tau結(jié)構(gòu)域,Phi屬于同一個(gè)超基因家族,此外EF1Bg(1-3)還具有其獨(dú)特的EF1G 結(jié)構(gòu)域。

圖2 綠豆GST蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domains of mung bean GST proteins

2.4 Vr GST系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

將Vr GST 與擬南芥和大豆GST 氨基酸序列共構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3),結(jié)果顯示GST 家族可分為三大分支,Tau類和Lambda類各占一個(gè)分支,其余8類聚為一支,Vr GST 與大豆GST 親緣關(guān)系較近,而與擬南芥GST 較遠(yuǎn),且綠豆和大豆具有較多的直系同源蛋白對,分別為Lambda類的VrGSTL1/GmGSTL3,DHAR類的VrDHAR2/Gm-DHAR2, EF1Bg 類 的 VrEF1Bg3/GmEF1Bg和Tau 類 的VrGSTU23/GmGSTU23、VrGSTU14/GmGSTU17、 VrGSTU9/GmGSTU8、 VrGSTU2/GmGSTU24、VrGSTU11/GmGSTU1、VrGSTU10/GmGSTU27、VrGSTU12/GmGSTU26、VrGSTU17/GmGSTU25,Tau 類在植物中最為豐富,其直系同源蛋白對也最多。

圖3 綠豆GSTs與擬南芥和大豆的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tress of GSTs from genomes of mung bean,A.thaliana and soybean

2.5 Vr GST在根、莖、葉中的表達(dá)模式

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,共有40個(gè)VrGSTs在綠豆根、莖或葉中表達(dá),其中Vr GSTF7、Vr GSTF8和Vr GSTF12 的表達(dá)量TPM 值接近于零,37 個(gè)Vr GST 表達(dá)模式見圖4,其中Vr GSTF2、Vr GSTF9 和Vr GSTU22 只 在 葉 中 表 達(dá),Vr GSTU27只在莖中表達(dá),Vr GSTL4 和Vr GSTU2只在根中表達(dá),其余31個(gè)基因在根莖葉中都表達(dá)。Vr DHAR1、Vr GSTF11、Vr GSTU6 等14個(gè)基因的表達(dá)量基本呈現(xiàn)根>莖>葉的趨勢,Vr GSTF1、Vr GSTF3、Vr GSTL3 等9 個(gè) 基 因 在莖中表達(dá)量最高,Vr DHAR2、Vr GSTU7、Vr GSTU8 等 7 個(gè)基因在葉中表達(dá)量最高。Vr DHAR1、VrGSTF1、Vr GSTU7、Vr GSTU8、VrGSTF11和Vr GSTF11 等基因在根、莖、葉中表達(dá)量都很高。其中Vr GSTU7和Vr GSTU8是葉中表達(dá)量最高的基因,在葉中最高分別達(dá)到817TPM 和266TPM ,同時(shí),Vr GSTU7也是莖中表達(dá)量最高的基因,表達(dá)量TPM 為250,根中表達(dá)量最高的Vr GSTF11 TPM 為200。結(jié)果表明,VrGSTs的表達(dá)具根、莖和葉的組織特異性,且基因在根莖葉中的表達(dá)沒有明顯的時(shí)序性。

圖4 綠豆VrGSTs在根、莖和葉中的表達(dá)譜(數(shù)據(jù)為log2 TPM 值)Fig.4 Expression pattern of VrGSTs in mung beanroot,stem,and leaf tissues(Data are shown as log2 TPM)

2.6 Cd脅迫對VrGST表達(dá)的影響

如圖5所示,Cd脅迫第1天,根、莖、葉中分別有11、6、6個(gè)Vr GSTs顯著上調(diào),平均上調(diào)倍數(shù)分別為2.48、1.99和2;分別有8、1、2個(gè)Vr GSTs顯著下調(diào),平均下調(diào)倍數(shù)分別為1.44、2.05 和1.5。Cd脅迫第5天,根、莖、葉中分別有11、11、9個(gè)Vr GSTs 顯著上調(diào),平均上調(diào)倍數(shù)分別為2.15、2.24和3.69;分別有8、2、2個(gè)Vr GSTs顯著下調(diào),平均下調(diào)倍數(shù)分別為2.59、1.48 和2.06。Cd脅迫第9 天,根、莖、葉中分別有11、11、5個(gè)Vr GSTs顯著上調(diào),平均上調(diào)倍數(shù)分別為1.88、2.53和4.09;分別有11、2、8個(gè)VrGSTs顯著性下調(diào),平均下調(diào)倍數(shù)分別為2.44、1.55 和1.61。其中,根、莖、葉中隨時(shí)間延長顯著上調(diào)的基因分別為10、8和4個(gè),平均上調(diào)倍數(shù)為2.17、2.25和3.26。表明差異表達(dá)Vr GSTs數(shù)量呈現(xiàn)根>莖>葉的明顯趨勢,說明Cd 脅迫對根中Vr GST 表達(dá)的影響最強(qiáng)。而且,莖中被Cd顯著上調(diào)的Vr GST 數(shù)量明顯多于顯著下調(diào)的數(shù)量,表明莖中Vr GST 在Cd 響應(yīng)中也起重要作用。有趣的是Vr GSTU2在對照組的莖中不表達(dá),而在Cd處理的第9天被顯著上調(diào)4.07倍。Cd脅迫下葉 中Vr GSTF3、VrGSTF6 和Vr GSTU1 分別被顯著上調(diào)達(dá)3.72、6.81 和5.87 倍;莖中VrGSTF11、VrGSTF6、Vr GSTU1、Vr GSTU2、Vr GSTU23和Vr GSTU28 分別被顯著上調(diào)達(dá)2.93、3.28、2.51、4.07、2.40 和2.03 倍;根 中Vr GSTF11、Vr GSTL3、Vr GSTL2-3、 Vr GSTU23、VrGSTU28 和Vr GSTU2 分 別 達(dá) 別 被 顯著上調(diào)3.17、1.39、2.89、2.52、3.32和3.29倍。VrGSTF5和VrGSTU16在根中被顯著下調(diào),而在葉被上調(diào);Vr GSTU23 在葉中被顯著下調(diào),但是在根和莖中都為上調(diào)。上述結(jié)果表明,Cd 對根、莖和葉中Vr GST 表達(dá)的影響不同,也說明根、莖、葉中響應(yīng)Cd脅迫的Vr GST 不相同。

圖5 Cd脅迫下綠豆GSTs表達(dá)譜(數(shù)據(jù)為log2 FC)Fig.5 Expression profile of mung bean GSTs in response to Cd stress(Data are shown as log2 FC)

2.7 谷胱甘肽(GSH)代謝途徑對Cd 脅迫的響應(yīng)

為進(jìn)一步了解GSH 代謝途徑對Cd脅迫的響應(yīng),對參與該途徑的基因表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組層面的分析,發(fā)現(xiàn)直接參與GSH 合成與分解的39個(gè)基因編碼14酶(圖6),包括4個(gè)γ-谷氨酰羥化酶/γ-谷氨酰肽酶(EC:2.3.2.2,3.4.19.13)、2個(gè)GSH 羥化酶(EC:2.3.2.2,3.4.19.13)、2 個(gè)γ-谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶(EC:4.3.2.9)、1個(gè)谷氨酸-半胱氨酸連接酶(EC:6.3.2.2)、6個(gè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC:1.1.1.49)、3個(gè)GSH 還原酶(EC:1.8.1.)、1個(gè)GSH 合酶(EC:6.3.2.3)、8個(gè)異檸檬酸脫氫酶(EC:1.1.1.42)、4個(gè)peroxiredoxin(EC:1.11.1.27)、1個(gè)GSH 過氧化物酶(EC:1.11.1.12)、1 個(gè)thiol-disulfide oxidoreductase(1.8.4.7)、2個(gè)thiosulfate sulfurtransferase(2.8.1.3),以及40個(gè)編碼GSTs(2.5.1.18)基因。這些基因的共同調(diào)控維持細(xì)胞內(nèi)GSH 動態(tài)平衡。基因表達(dá)分析表明,根中大多數(shù)基因被Cd下調(diào),而葉和莖中大多數(shù)基因被Cd上調(diào),這一方面說明,由于根、莖和葉中Cd濃度不同,對基因表達(dá)的影響不同;另一方面說明根、莖和葉中參與GSH 代謝基因?qū)d的響應(yīng)不同。在莖和葉中,上述基因表達(dá)水平上調(diào),促進(jìn)了GSH 合成和GSH 與GSSG 之間的轉(zhuǎn)化,而在根中這些基因表達(dá)的下調(diào)和GSTs的上調(diào),會影響細(xì)胞內(nèi)GSH 的水平。然而,由于GSTs催化一個(gè)R 基團(tuán)(主要是烷基和芳香基)轉(zhuǎn)移到GSH 上,而無外源供給時(shí),細(xì)胞內(nèi)并不會積累烷基和芳香基。因此,Cd脅迫導(dǎo)致GSTs基因表達(dá)上調(diào)和酶活性升高,可能不直接造成GSH 減少,影響細(xì)胞內(nèi)GSH 平衡。

圖6 谷胱甘肽代謝途徑對Cd脅迫的響應(yīng)(圖中熱圖表示該基因在葉、莖和根中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá))Fig.6 Response of glutathione metabolism to Cd stress(Heat maps show expression of corresponding genes in leaves(L),stems(S),and roots(R)at threepoint-in-time)

2.8 Cd脅迫對GST酶活性的影響

GST 酶活性分析表明(圖7),對照組根、莖和葉中平均GST 酶活性分別為163.85 U/g、173.79 U/g和276.59 U/g,表明葉中的酶活高于莖和根。Cd處理組根、莖和葉中平均GST 酶活性分別為350.85 U/g、216.09 U/g和265.78 U/g,根和莖中GST 酶活分別上升2.14和1.27倍,根中的酶活變化顯著高于莖和葉,這與Vr GST 表達(dá)譜(圖4)和Cd處理對其表達(dá)的影響結(jié)果一致(圖5)。Cd處理對葉中GST 活性影響較小(圖7-a),只在第1天顯著降低葉中GST 活性下。然而,Cd顯著升高莖中第5、7、9 天GST活性,分別比對照組提高29%、27%和27%;顯著升高根中1、3、5、7、9 d GST 活性,分別比對照組提高了48%、53%、50%、59%和51%。顯然,Cd對根中GST 活性的影響最大,莖中GST 活性對Cd的響應(yīng)具有滯后性。也說明根中GSTs在響應(yīng)Cd脅迫中起最主要作用。

圖7 Cd脅迫綠豆葉(a)、莖(b)和根(c)中GST酶活性Fig.7 Activity of GST enzyme in leaf(a),stem(b),and root(c)tissuesunder Cd stress

3 討論

GST 因其在植物響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用而被廣泛關(guān)注,研究者通過全基因鑒定了101個(gè)大豆[23]、62個(gè)柑橘[24]、81個(gè)毛果楊[3]、54個(gè)擬南芥[25]、59 個(gè)水稻[26]GST 家族成員,本研究鑒定了93個(gè)綠豆GST 家族成員,表明不同植物中GST 基因家族成員的數(shù)量差異較大,就目前結(jié)果而言,豆科植物具有更多GST 家族成員。綠豆93個(gè)Vr GSTs中Phi和Tau數(shù)量最多,這與Phi和Tau類在植物中含量最豐富一致[27]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,不同類型的Vr GST 內(nèi)含子與外顯子的數(shù)目和分布存在較大差異,同一類Vr GSTs具有相似的結(jié)構(gòu),與甘藍(lán)型油菜GST 結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相一致[27]。Tau類含有2個(gè)外顯子,Phi類含有3 個(gè)外顯子,與大豆GST 結(jié)構(gòu)相類似[23],也符合高等植物Tau 類和Phi類的GST特 征[28]。Vr GST 的 Zeta、Lambda、Theta、DHAR、EF1Bg 和mPGES2 類 有6 個(gè) 以 上 外 顯子,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[29-30]。所有確定的Vr GSTmotif中,motif 2 存在于91%的基因中,Tau 含有所有的motif,類似于已經(jīng)報(bào)道[31]。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明,綠豆、大豆和擬南芥屬于同一亞類的GSTs聚集在一起,且綠豆和大豆的親緣關(guān)系最近,具有多個(gè)直系同源蛋白對。GST有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:N 端和C 端結(jié)構(gòu)域。N 端結(jié)構(gòu)域包含α-螺旋和β-鏈,C端結(jié)構(gòu)域均為α-螺旋結(jié)構(gòu)。除Vr DHAR2、VrGSTL2-1、VrGSTL2-4和Vr GSTL4只含有GST_N 端結(jié)構(gòu)域,Vr GSTF7 和Vr GSTF8只含有GST_C 端結(jié)構(gòu)域,其余Vr GSTs都含有為GST_N 和GST_C結(jié)構(gòu)域,N 端結(jié)構(gòu)域類型和位置更為穩(wěn)定,這意味著N 端結(jié)構(gòu)域更保守,這與在其他植物中研究的結(jié)果類似[3,23,32]。所有植物的GSTs分子質(zhì)量約為50 ku,由兩個(gè)大小相似(約25 ku)的亞基組成,等電點(diǎn)在4～5[33]。綠豆Tau類和Phi類的分子質(zhì)量在以前研究的數(shù)據(jù)范圍內(nèi),但是EF1Bg、GHRs和mPGES2類最高分別為47.73、42.19和40.19 ku,此結(jié)果與Swati對綠豆GST 蛋白分析的結(jié)果相同[31],說明不同植物間GST 的理化性質(zhì)也存在很大的差異。亞細(xì)胞定位分析表明,Vr GSTs主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,其中VrGSTT2、Vr GSTF10、Vr GSTF11、VrmPGES2 定 位 于 線 粒 體中,參與維持線粒體中的GSH:GSSG 比率,這符合線粒體中有高濃度GSH[34];Vr GSTU1、Vr GSTL1等19個(gè)定位于葉綠體,葉綠體的GSTs在其他植物中也有鑒定[35]。

GST 的表達(dá)存在組織差異性和特異性[36],綠豆Vr GSTF2、Vr GSTF9和Vr GSTU22只在葉中表達(dá),Vr GSTU27 只在莖中表達(dá),VrGSTL4 和Vr GSTU2只在根中表達(dá),Vr GSTU7在葉和莖中表達(dá)量最高,VrGSTF11在根中表達(dá)量最高。He等[36]對薺菜的研究表明,25個(gè)Tau類GSTs中,13個(gè)在所有檢測的組織中表達(dá),12 個(gè)選擇性表達(dá)。其中Cr GSTU23僅在根組織中表達(dá),Cr GSTU5和CrGSTU19 僅在種子組織中表達(dá),而Cr GTU10 僅 在 下 胚 軸 區(qū) 表 達(dá),12 個(gè)Phi 類GSTs,5個(gè)在所有組織中表達(dá),5個(gè)選擇性表達(dá),還有兩個(gè)在所有組織中都不表達(dá)。酶活分析表明,對照組中酶活呈現(xiàn)葉>莖>根的趨勢,這可能與Vr GSTU7在莖葉中的高表達(dá)有關(guān),Vr GSTU7在莖和葉中的表達(dá)量分別達(dá)到TPM 680 和TPM250,而根中表達(dá)量最高的Vr GSTF11只達(dá)到TPM 200,可能與GSTs參與莖和葉中色素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[37]。形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示,Cd脅迫嚴(yán)重影響綠豆幼苗的生長。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),Cd 脅迫下,根和莖中上調(diào)基因的數(shù)量明顯高于葉中,相應(yīng)的根和莖中的GSH 酶活明顯增高,這與根直接接觸Cd有關(guān)。且Vr GSTF6在葉和莖中上調(diào)最明顯,其差異表達(dá)倍數(shù)在1 d、5 d、9 d都在5倍和3倍以上,Vr GSTU28在根中的差異表達(dá)倍數(shù)在1 d、5 d、9 d也都在3倍以上。他們可能是根和莖中酶活的主要貢獻(xiàn)者。有研究將剛毛怪柳ThGSTZ1在擬南芥中過表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株GST酶活在Cd脅迫下高于野生株[38]。為驗(yàn)證GSTU在白菜抗Cd 中的作用,將BcGSTU4、BcGSTU11、BcGSTU12和BcGSTU22在酵母中表達(dá),發(fā)現(xiàn)BcGSTU11提高了酵母對Cd的耐受性[15]。這些研究都表明,GST 在植物響應(yīng)Cd脅迫中起作用。

重金屬脅迫導(dǎo)致植物ROS 爆發(fā),過量的ROS抑制酶活性,引發(fā)脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化等。因此,Cd 脅迫下,具有過氧化物酶活性的GSTs,與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶共同參與ROS清除,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)[39]。而且,GST 發(fā)揮Ⅱ期解毒作用,GST 催化GSH 結(jié)合過氧化產(chǎn)物和游離的Cd,降低Cd對綠豆的毒害。此外,GST 在響應(yīng)鹽[40]和干旱[11]等非生物脅迫以及病原菌[41]等生物脅迫中也起重要作用。Wang等[42]研究表明,干旱條件下,轉(zhuǎn)基因香蕉MaGSTU2和MaGSTU3表達(dá)量顯著升高,表明這兩個(gè)基因響應(yīng)干旱脅迫。鹽、干旱、低溫及重金屬等非生物脅迫都能引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,脂質(zhì)過氧化和活性氧的產(chǎn)生,植物GST 通過抗氧化酶活性修復(fù)自由基引起的膜磷脂損傷、抑制微粒體過氧化反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗氧化作用[43]。本研究獲得的Vr GSTs有望為運(yùn)用基因工程手段提高或改善植物重金屬抗性的研究,提供有價(jià)值的科學(xué)資料和依據(jù)。