玉米BBX基因家族鑒定及表達(dá)分析

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(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心/黑龍江省普通高校寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319)

鋅指(結(jié)構(gòu))蛋白作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠與核酸及蛋白質(zhì)互作,參與多種生物學(xué)過(guò)程調(diào)控[1]。其中一個(gè)亞家族B-box(BBX)蛋白N 端至少含有一個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域,有的成員會(huì)多一個(gè)B-box或CCT(CONSTANS,CO-like and TOC1)結(jié)構(gòu)域,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]。值得一提的是,CCT 結(jié)構(gòu)域也是具有轉(zhuǎn)錄因子活性的基因家族[4-5]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)CONSTANS(CO)/At BBX1 作為該家族的典型代表,已成為光周期途徑調(diào)控開(kāi)花的主導(dǎo)者[6-8],同時(shí)還有At BBX4[9]、AtBBX6[10]、At-BBX7[11]和At BBX28[12]等成員參與開(kāi)花調(diào)控。其中AtBBX28通過(guò)與AtBBX1互作,調(diào)控開(kāi)花Flowering Locus T(FT)基因表達(dá)[12];當(dāng)然BBX家族對(duì)開(kāi)花的調(diào)控也存在不依賴AtBBX1的通路[13]。眾所周知,光周期對(duì)開(kāi)花的調(diào)控歸根結(jié)底是對(duì)光信號(hào)的響應(yīng),包括避蔭反應(yīng)[13]。在光敏色素和隱花色素依賴途徑中,依據(jù)與通路中兩標(biāo)志因子 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1(COP1)和ELONGATED HYPOCOTYL 5(HY5)的關(guān)系,將BBX 參與光形態(tài)建成信號(hào)通路大致分為4 種類型,即雙因子依賴、依賴COP1不依賴HY5、不依賴COP1 依賴HY5 和雙不依賴[2]。當(dāng)然COP1 可以激活也可以抑制BBX,BBX 亦可激活也可抑制HY5,形成復(fù)雜的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)植物對(duì)光的形態(tài)建成調(diào)控。其中,At BBX24不僅參與可見(jiàn)光的形態(tài)建成,也參與UV-B光介導(dǎo)的形態(tài)建成[14-15]。近來(lái)發(fā)現(xiàn),蘋果(Malus domestica)MdBBX37直接與光信號(hào)正向調(diào)節(jié)因子Md HY5的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá),從而解除Md HY5介導(dǎo)的下胚軸抑制[16]。

植物BBX 除參與光生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控,還參與對(duì)多種逆境和激素的應(yīng)答[2,17]。例如,AtBBX18和AtBBX24分別參與對(duì)熱和鹽等非生物逆境響應(yīng)[18-19]。Md BBX37調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的耐冷性,通過(guò) JAZ (JAZ MONATE ZIM-DOMAIN)-BBX37-ICE1(inducer of CBF expression 1)-CBF(C-repeat binding factor)級(jí)聯(lián)通路提高耐冷性[20]。 菊 花 (Chrysanthemum morifolium)CmBBX19通過(guò)與ABF3 模塊通過(guò)ABA(脫落酸)依賴的途徑在菊花的耐旱性調(diào)控中發(fā)揮作用[21]。甜薯(Ipomoea batatas)IbBBX24可以通過(guò)調(diào)控茉莉酸合成和信號(hào)途徑增強(qiáng)植物對(duì)紋枯病的抗性并提高產(chǎn)量[22]。目前,已有研究對(duì)擬南芥[23]、水稻[24](Oryza sativa)、番茄[25](Solanum lycopersicum)、蘋果[26-27]、葡萄[28](Vitis vinifera)和矮牽牛[29](Petunia hybrida)等多個(gè)物種中BBX基因家族進(jìn)行鑒定。然而關(guān)于高光效C4作物玉米(Zea mays)BBX 基因家族系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定出玉米BBX 所有成員,對(duì)家族基因特征、全生育期和非生物逆境下表達(dá)情況,并對(duì)生育期組織基因的共表達(dá)進(jìn)行分析,為揭示玉米BBX 基因家族成員的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛋白鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載玉米、擬南芥、水稻、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和番茄基因組數(shù)據(jù),以擬南芥和水稻BBX 家族成員蛋白序列為模板,利用TBtools軟件獲取候選ZmBBX 蛋 白 序 列,并 上 傳 到 NCBI CD-Search、PFAM、SMART 進(jìn)一步驗(yàn)證。利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)量,利用PSORT 網(wǎng)站(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

利用MegaX(https://www.megasoftware.net/)進(jìn)行ClustalW 多重對(duì)比,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),生成算法為ML(Maximum Likelihood),校驗(yàn)參數(shù)Bootsrtrap重復(fù)1 000次。

1.2 基因結(jié)構(gòu)及其啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools繪制基因在染色體上的分布圖及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖;取翻譯起始點(diǎn)ATG 上游2 000 bp和1 000 bp啟動(dòng)子序列提交Plant-CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/)進(jìn)行順式作用元件分析。利用MCScan X 進(jìn)行物種間共線性分析。

1.3 蛋白結(jié)構(gòu)及互作蛋白預(yù)測(cè)分析

利用 MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析蛋白保守基序,并利用TBtools繪制保守基序圖。使用STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 逆境和全生育期組織表達(dá)譜

逆境(低溫、高溫、鹽、紫外)的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于SRA 數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為低溫(SRR1238717,SRR1819204,SRR1819205)、高溫(SRR1238715,SRR1819196,SRR1819198)、鹽(SRR1238719)和紫外(SRR1238720)。玉米全生育期的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于Maize eFP Browser(http://bar.utoronto.ca/efp_maize/)數(shù)據(jù)庫(kù)。從NCBI-GEO 下載GSE50191轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù),提取其中的FPKM 值轉(zhuǎn)化為TPM 值作為基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.5 組織表達(dá)數(shù)據(jù)的共表達(dá)分析

使用TBtools進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,以至少6成樣本中該基因的TPM 值>1為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行篩選,構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)與劃分相關(guān)模塊,閾值為0.8軟閾值為β=22,并繪制模塊-性狀熱圖。利用TBtools 軟件進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析,以玉米基因組為參考數(shù)據(jù)庫(kù),利用TBtools進(jìn)行可視化,設(shè)置數(shù)量參數(shù)為30。

1.6 鹽脅迫表達(dá)分析

以玉米自交系合344為供試材料,1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心期進(jìn)行處理。在營(yíng)養(yǎng)液中添加150 mmol/L NaCl,分別于處理0 d、1 d、3 d和7 d取樣,將地上和地下部分離,用液氮冷凍存放于-80 ℃冰箱中保存。每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用TRIZOL 試劑提取玉米葉片和根組織總RNA,純化后構(gòu)建c DNA 文庫(kù),通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)富集cDNA 文庫(kù),然后使用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序(SRP176441 和SRP307694)。抽取BBX基因構(gòu)建鹽處理下根和葉表達(dá)譜,相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法為:首先將3次生物學(xué)重復(fù)處理的FPKM 平均值與對(duì)照(0 d)平均值相比,然后對(duì)二者比值進(jìn)行l(wèi)og2FC轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換值即為相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmBBX基因家族成員的鑒定與命名

獲得34個(gè)ZmBBX 基因家族成員,按照基因在染色體的位置依次命名為ZmBBX1-ZmBBX34(表1)。家族成員中蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度為142～498 aa,分子質(zhì)量為15.38～53.77 ku;等電點(diǎn)為4.55～10.52。預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),除ZmBBX5、ZmBBX19、ZmBBX26定 位 于 細(xì) 胞質(zhì),Zm BBX9、Zm BBX24、ZmBBX25、Zm BBX30和ZmBBX32定位于線粒體,ZmBBX33定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外,其余成員均定位于細(xì)胞核內(nèi)。

表1 ZmBBX 基因編碼蛋白序列理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of protein sequence encoded by ZmBBX gene

2.2 ZmBBX家族成員蛋白進(jìn)化分析

選取鑒定的34個(gè)玉米、32個(gè)擬南芥、30個(gè)水稻、22個(gè)二穗短柄草和29個(gè)番茄BBX 家族成員進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,根據(jù)含有B-box 和CCT結(jié)構(gòu)域的情況,ZmBBX家族可分為5個(gè)亞家族(Ⅰ～Ⅴ)(圖1),第Ⅰ亞族只含有2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域,包括ZmBBX4、ZmBBX6、ZmBBX7、ZmBBX8、ZmBBX11、Zm BBX16、Zm BBX18、Zm BBX20、ZmBBX23、ZmBBX24、ZmBBX27、ZmBBX28和Zm BBX34等13個(gè)家族成員;第Ⅱ和Ⅴ亞族含有2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT 結(jié)構(gòu)域,但其B-box 在氨基酸序列上有差異,分別包括ZmBBX1、ZmBBX2、ZmBBX5、ZmBBX9、ZmBBX19、ZmBBX30、Zm BBX32和ZmBBX33等8個(gè)成員和Zm BBX12、ZmBBX13、Zm BBX21 和ZmBBX31等4個(gè)成員;第Ⅲ亞族含有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT 結(jié)構(gòu)域,包括ZmBBX3、Zm BBX15、ZmBBX22、ZmBBX26 和ZmBBX29 等5個(gè)成員;第Ⅳ亞族只含有1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域,包括ZmBBX10、ZmBBX14、ZmBBX17 和ZmBBX25等4個(gè)成員。各個(gè)亞家族中玉米與水稻、二穗短柄草聚成一支,表明雙子葉與單子葉植物的進(jìn)化存在差異。

圖1 ZmBBX家族成員蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Protein phylogenetic tree of ZmBBX family member

2.3 ZmBBX家族成員基因進(jìn)化分析

對(duì)玉米、水稻、二穗短柄草的BBX 家族基因進(jìn)行共線性分析(圖2),34個(gè)Zm BBX基因不均勻地分布在10條染色體上,其中5號(hào)染色體上分布的成員最多,涉及Zm BBX15～Zm BBX21共8個(gè),8號(hào)染色體上不存在BBX 家族成員。另外,18個(gè)ZmBBX同源基因出現(xiàn)在二穗短柄草和水稻染色體中,供試禾本科作物基因組BBX 具有較好的共線性,這與進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果一致。同時(shí),對(duì)Zm BBX 家族基因進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)事件分析,共有11對(duì)重復(fù)基因,分別是ZmBBX3～Zm BBX15、ZmBBX4～Zm BBX20、Zm BBX7～Zm BBX27、ZmBBX11～ZmBBX18、ZmBBX12～Zm BBX21、ZmBBX14～Zm BBX17、ZmBBX16～ZmBBX24、Zm BBX17-Zm BBX25、Zm BBX23～ZmBBX28、ZmBBX34～Zm BBX4、Zm BBX34～ZmBBX20,其Ka/Ks 值 介 于0.187 856～0.570 824之間,二者比值小于1說(shuō)明其受到純化選擇。

圖2 ZmBBX家族染色體定位(A)及二穗短柄草、玉米、水稻間共線性(B)Fig.2 Chromosome location of ZmBBX family(A)and collinearity analysis among Brachypodium distachyon,Zea mays and Oryza sativa(B)

2.4 ZmBBX家族基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)分析

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)成員含有2～8個(gè)保守基序(圖3-A、3-C),所有成員均含有B-box結(jié)構(gòu)域核心序列(Motif 1)。其中ZmBBX4、Zm BBX5、ZmBBX6、Zm BBX7、Zm BBX8、Zm BBX11、ZmBBX12、ZmBBX13、ZmBBX16、ZmBBX18、Zm BBX19、Zm BBX20、Zm BBX21、Zm BBX23、Zm BBX24、ZmBBX27、ZmBBX28、ZmBBX31和Zm BBX3419 個(gè) 成 員 含 有 另 一 個(gè)B-box 保 守 域(Motif 3);ZmBBX1、ZmBBX2、ZmBBX3、ZmBBX5、ZmBBX9、ZmBBX12、ZmBBX13、ZmBBX15、ZmBBX19、ZmBBX21、ZmBBX22、ZmBBX26、ZmBBX29、ZmBBX30、Zm BBX31、ZmBBX32和ZmBBX3317 個(gè) 成 員 除 了 具有典型的B-box 結(jié)構(gòu)域外,還含有CCT 結(jié)構(gòu)域(Motif 3)。

對(duì)Zm BBX 家族成員的基因內(nèi)含子和外顯子分析(圖3-B),第Ⅰ組成員內(nèi)含子數(shù)量為1～5個(gè),第Ⅱ組為0～3個(gè),第Ⅲ組和Ⅳ均為3～4個(gè),第Ⅴ組為0～2個(gè)。其中,Zm BBX9、ZmBBX14、ZmBBX17、ZmBBX25和ZmBBX33沒(méi)有內(nèi)含子,ZmBBX28內(nèi)含子數(shù)目最多為5個(gè)。

圖3 ZmBBX家族保守結(jié)構(gòu)域(A和C)及基因結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 ZmBBX family conserved domain(A and C)and gene structure(B)

2.5 ZmBBX家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

通過(guò)基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)元件分析發(fā)現(xiàn),除啟動(dòng)子核心元件TATA-box、CAAT-box以外,Zm BBX 家族基因啟動(dòng)子還存在四大類作用元件(圖4-A),如光響應(yīng)相關(guān)元件G-box、Sp1、GT1-motif等20 種,環(huán)境脅迫相關(guān)元件ARE、MBS等7種,以及ABRE、P-box等5種激素應(yīng)答相關(guān)元件,同時(shí)還有生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件CATbox、O2-site等5種。光響應(yīng)、激素應(yīng)答、環(huán)境脅迫相關(guān)元件均分布在所有Zm BBX 成員中,除ZmBBX1、ZmBBX23和ZmBBX27外其余家族成員均含有生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件。ZmBBX家族基因上游1 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域部分元件的數(shù)量及位置統(tǒng)計(jì)如下(圖4-B),其中光響應(yīng)元件(G-box)以及脫落酸應(yīng)答元件(ABRE)數(shù)目較多分布廣泛,且在5′-3′鏈上數(shù)目較多;參與低溫響應(yīng)的元件(LTR)在ZmBBX11上數(shù)目最多;其余元件(GT1-motif、TGA-element、CAT-box、O2-site、ARE)在部分成員中也有分布但數(shù)目較少。

圖4 ZmBBX家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分布(A)及數(shù)目(B)Fig.4 Distribution(A)and number(B)of cis-acting elements in promoter of ZmBBX gene family

2.6 ZmBBX家族基因全生育期組織表達(dá)譜分析

ZmBBX 家族(除ZmBBX24)在玉米全生育期的基因表達(dá)模式分為3 大類,進(jìn)一步細(xì)分為5小 類(圖5)。其 中,ZmBBX 7、ZmBBX 2 7和ZmBBX28等3個(gè)基因在玉米全生育期的表達(dá)量都很高并在表達(dá)模式中聚為第一大類;第二大類包括在全生育期具有表達(dá)但表達(dá)量較低的Zm BBX2、Zm BBX4、ZmBBX8、Zm BBX9、ZmBBX10、ZmBBX16、ZmBBX17、ZmBBX25、ZmBBX26、ZmBBX29、Zm BBX31、ZmBBX33和ZmBBX3413個(gè)基因在內(nèi)的第一類和表現(xiàn)出較為明顯的組織特異性,在玉米葉片中表達(dá)量較高的ZmBBX3、ZmBBX5、Zm BBX14、ZmBBX15、Zm BBX19、ZmBBX20和ZmBBX227 個(gè)基因的第二類。第三大類包括3 個(gè)亞類,第一亞類涉及ZmBBX6、ZmBBX11、Zm BBX18和Zm BBX324 個(gè) 成 員,在玉米葉片、種子形成前期和第一莖節(jié)間等組織部位特異表達(dá);第二亞類涉及ZmBBX1、Zm BBX12、ZmBBX13和ZmBBX234個(gè)成員,在葉片、苞葉、胚胎、種子、胚乳中表達(dá)量較高,且Zm BBX12和Zm BBX13在各組織中表達(dá)量完全一致;第三亞類涉及Zm BBX21和Zm BBX302 個(gè)成員,在全生育期均有表達(dá)但整體表達(dá)量較低。

圖5 ZmBBX家族基因全生育期表達(dá)分析Fig.5 Expression of ZmBBX family gene during whole growth period

2.7 生育期共表達(dá)的GO 和KEGG 富集分析

以GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE50191轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)構(gòu)建全生育期基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),通過(guò)對(duì)篩選的18 000個(gè)基因進(jìn)行分析獲得8個(gè)共表達(dá)模塊(圖6-A、6-B)。在所有模塊中有19 個(gè)Zm BBX基因在列,其中MEbrown 和MEblue模塊中的數(shù)目最多,分別包括ZmBBX1、ZmBBX4、Zm BBX10、ZmBBX16、ZmBBX32和Zm BBX7、Zm BBX19、ZmBBX27、Zm BBX28、Zm BBX34,MEturquoise 中 包 括ZmBBX11、ZmBBX18、Zm BBX30和Zm BBX31,MEblack 中 包 括ZmBBX17和ZmBBX33,MEpink、MEred、MEmagenta中分別包括ZmBBX2、ZmBBX5和Zm BBX24。依據(jù)模塊與表型性狀的相關(guān)性,選擇有Zm BBX基因參與的且與GK 2相關(guān)性最高的MEbrown模塊進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析(圖6-C、6-D),其模塊與性狀的相關(guān)系數(shù)為0.9和P值為0.002。GO 富集分析發(fā)現(xiàn),基因分子功能主要富集于蛋白質(zhì)異二聚活性(GO:0046982)和磷酸甘油酸變位酶活性(GO:0004619),細(xì)胞組分富集于細(xì)胞質(zhì)(GO:0005737)和微體(GO:0042579),生物過(guò)程富集于有機(jī)酸代謝過(guò)程(GO:0006082)、羧酸代謝過(guò)程(GO:0019752)和含氧酸代謝過(guò)程(GO:0043436)等。KEGG 分析發(fā)現(xiàn),該模塊主要涉及代謝和碳水化合物代謝等代謝過(guò)程,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工的遺傳信息過(guò)程,過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞過(guò)程,外泌體和脂質(zhì)合成蛋白等蛋白功能。

圖6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(A和B),關(guān)鍵模塊GO 功能富集分析(C)和KEGG 富集分析(D)Fig.6 Co-expression network construction(A and B),GO enrichment analysis of key modules(C)and KEGG enrichment analysis(D)

2.8 鹽處理下ZmBBX家族基因表達(dá)譜

Zm BBX 家族成員在NaCl處理玉米幼苗根和葉中表達(dá)不盡相同(圖7)。玉米幼苗葉片中差異表達(dá)(log2FC≥1)的ZmBBX基因共有17個(gè),上調(diào)的有13個(gè)和下調(diào)的4個(gè);其中l(wèi)og2FC≥2的有10個(gè),上調(diào)的8個(gè)和下調(diào)的2個(gè)。同時(shí),玉米幼苗根中差異表達(dá)(log2FC≥1)的Zm BBX基因共有19個(gè),上調(diào)的有13 個(gè)和下調(diào)的6 個(gè);其中l(wèi)og2FC≥2的有2個(gè),均上調(diào)表達(dá)。

圖7 ZmBBX家族基因葉(A)和根(B)響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of ZmBBX family in leaves(A)and roots(B)under salt stress

地上和地下都差異表達(dá)(log2FC≥1)的ZmBBX基因有9個(gè),包括ZmBBX1、ZmBBX3、ZmBBX9、Zm BBX12、ZmBBX13、Zm BBX21、ZmBBX25、ZmBBX29和Zm BBX33,其 中 除ZmBBX3在葉片中下調(diào)和根中上調(diào),其余ZmBBX 在葉片和根中基本都上調(diào)表達(dá)。值得一提的是,差異表達(dá)倍數(shù)較大(log2FC≥4)的基因有3個(gè),其中葉片中Zm BBX16上調(diào)表達(dá)和Zm BBX26下調(diào)表達(dá),根中ZmBBX3明顯上調(diào)表達(dá)。

2.9 ZmBBX蛋白互作及逆境表達(dá)譜分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)BBX 的蛋白互作特性(圖8-A)。整個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)有23個(gè)節(jié)點(diǎn),節(jié)點(diǎn)之間共存在45 組蛋白互作關(guān)系。其中Zm BBX14、Zm BBX17 和ZmBBX25 位 于 整 個(gè)BBX 基因家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的中心,分別與Zm BBX2、Zm BBX4、ZmBBX7、ZmBBX16、Zm BBX20、ZmBBX24、ZmBBX27 和ZmBBX34 這8個(gè)家族成員互作,還發(fā)現(xiàn)其他家族蛋白MYBR20、glk45、GRMZM2G181030 都 與 Zm BBX12、ZmBBX13、ZmBBX21 和ZmBBX31 有 互作關(guān)系,且glk45還與ZmBBX19和Zm BBX30存在互作關(guān)系。結(jié)合逆境基因共表達(dá)分析(圖8-B)ZmBBX21與GRMZM2G181030、MYBR20表 達(dá)模式相似,都在低溫脅迫下高表達(dá),其中MYBR20在低溫下表達(dá)量大幅上調(diào),在轉(zhuǎn)錄水平上支持蛋白互作。

3 討論

植物轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)其特有結(jié)構(gòu)域與DNA 及其他蛋白相互作用,激活或抑制基因的表達(dá)[30],其中植物BBX 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[2]。本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定出玉米34個(gè)Zm BBX,依據(jù)蛋白進(jìn)化該家族可以劃分為5個(gè)亞族。其中,劃歸第Ⅰ亞族的8個(gè)(AtBBX18～At BBX25)擬南芥家族成員均已報(bào)道參與光(暗)的形態(tài)建成,且AtBBX22、At-BBX24和At BBX25均可以與COP1和HY5 互作[2],推測(cè)同組Zm BBX4、ZmBBX6、ZmBBX7、ZmBBX8、ZmBBX11、ZmBBX16、ZmBBX18、ZmBBX20、ZmBBX23、ZmBBX24、ZmBBX27、ZmBBX28和ZmBBX34這13 基 因 可 能 也 參 與玉米對(duì)光形態(tài)建成的調(diào)控。第Ⅱ亞族中包括6個(gè)(AtBBX1～AtBBX6)擬南芥家族成員,該亞族基因涉及開(kāi)花調(diào)控、氣孔開(kāi)放、逆境響應(yīng)等生理作用[2],推測(cè)同組玉米ZmBBX1、Zm BBX2、Zm BBX5、ZmBBX9、ZmBBX19、ZmBBX30、ZmBBX32和Zm BBX33這8個(gè)基因也具有類似功能,其中ZmBBX30與OsBBX18/Hd1[31]直系同源,參與花期調(diào)控,值得一提的是,本組Zm BBX19/Zm-COL3已被鑒定在玉米花期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[32]。第Ⅴ亞族中包括9 個(gè)擬南芥AtBBX 成員,其中AtBBX7、AtBBX9、AtBBX11和AtBBX13主要參與對(duì)生物逆境和非生物逆境的響應(yīng)[2],推 測(cè) 同 組Zm BBX12、Zm BBX13、Zm BBX21和ZmBBX31這4 個(gè) 基 因 參 與 玉 米 對(duì) 逆 境的應(yīng)答,而且本研究也發(fā)現(xiàn)上述4個(gè)基因均可以被鹽處理誘導(dǎo)表達(dá),其中Zm BBX12、ZmBBX13和ZmBBX21具有相同組織表達(dá)模式。此外,與ZmBBX31聚于一個(gè)分支的OsBBX7/DTH2為水稻抽穗調(diào)控基因[33],推測(cè)該基因還參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。

本研究中對(duì)鹽脅迫下玉米幼苗ZmBBX 家族基因的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有24 個(gè)Zm BBX基因參與玉米幼苗對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答,包括地上和地下都差異表達(dá)的9 個(gè)Zm BBX基因,分別為ZmBBX1、ZmBBX3、ZmBBX9、ZmBBX12、ZmBBX13、Zm BBX21、ZmBBX25、ZmBBX29和Zm BBX33,其中根部ZmBBX3明顯上調(diào)表達(dá)。此外葉片ZmBBX16上調(diào)和Zm BBX26下調(diào)亦十分明顯。另一方面,從全生育期組織表達(dá)結(jié)果來(lái)看ZmBBX7、Zm BBX27和Zm BBX28在玉米全生育期的表達(dá)量都很高,ZmBBX21和ZmBBX30在全生育期均有表達(dá)但整體表達(dá)量較低,且部分基因具有較明顯的組織表達(dá)特異性。上述基因的表達(dá)支持了本研究Zm BBX基因啟動(dòng)子存在大量光、生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫以及激素應(yīng)答等相關(guān)順式作用元件的結(jié)果。進(jìn)一步通過(guò)全生育期共表達(dá)分析 發(fā) 現(xiàn),ZmBBX1、ZmBBX4、ZmBBX10、ZmBBX16和ZmBBX32等基因可能參與光響應(yīng)的萌發(fā)籽粒的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育[34],而且可能通過(guò)蛋白二聚化分子功能,調(diào)控細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中糖和酸代謝等生物學(xué)功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。

通過(guò)互作蛋白預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),同屬第Ⅴ類的ZmBBX12、ZmBBX13、ZmBBX21 和ZmBBX31等BBX 蛋白與已知的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子家族成員MYBR20[35]和glk45[36]構(gòu)成一個(gè)互作組;同時(shí),多種逆境表達(dá)譜分析也發(fā)現(xiàn)ZmBBX21和MYBR20共聚一類,該共表達(dá)模式也支持了蛋白互作的預(yù)測(cè)結(jié)果。此外,Zm BBX14、ZmBBX17和ZmBBX25居于BBX 家族同源互作的核心,多種逆境表達(dá)模式下Zm BBX14和ZmBBX17相近,ZmBBX17和ZmBBX25全生育期組織表達(dá)模式相近,不僅支持蛋白互作預(yù)測(cè),而且表明ZmBBX 同源互作可能具有分工,用于協(xié)調(diào)逆境與生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究在玉米基因組水平共鑒定出BBX 基因家族成員34個(gè),Zm BBX 家族基因生育期組織表達(dá)和逆境表達(dá)分化明顯,在鹽等非生物逆境和光相關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。