馬鈴薯HSP90 基因家族的全基因組鑒定及高溫干旱脅迫下的表達(dá)分析

楊 芳喬 巖王永強(qiáng)李 茜李 丹王亞士柴薇薇

(1.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院,甘肅慶陽 745000;2.隴東旱地作物種質(zhì)改良及產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅慶陽 745000;3.甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅慶陽 745000;4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,蘭州 730000;5.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730000)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是全世界最重要的糧食作物之一,具有較高的投入產(chǎn)出比,其適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、耐旱、耐瘠薄,但不耐高溫,高溫導(dǎo)致馬鈴薯莖節(jié)間伸長、葉片變小,降低光合效率,塊莖發(fā)生退化、畸形,生長停滯,造成嚴(yán)重減產(chǎn)[1]。近百年來,中國地表平均氣溫升高幅度約為0.5～0.8 ℃,增溫速率為0.08 ℃/10 a,是全球氣候變暖最顯著的國家之一;近50 a來的溫度增幅尤為明顯,西北地區(qū)的增溫速率為0.33℃/10 a,明顯高于全國平均水平[2]。極端高溫事件給西北地區(qū)馬鈴薯的生長發(fā)育和生產(chǎn)安全帶來了巨大挑戰(zhàn),因此提高馬鈴薯非生物脅迫抗性具有重要意義。作物在長期進(jìn)化過程中形成了適應(yīng)不良環(huán)境的分子機(jī)制,在面對(duì)高溫等逆境脅迫時(shí),為避免細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到破壞,細(xì)胞內(nèi)會(huì)迅速合成大量的分子伴侶蛋白,這類蛋白被稱為熱激蛋白(HSP,Heat shock protein)。HSP蛋白具有重要調(diào)控功能,有助于錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)恢復(fù)正常構(gòu)象并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),保護(hù)植物在高溫、寒冷、干旱、鹽等逆境脅迫下生存[3]。在植物中,HSP 可分為5個(gè)家族:HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和小分子熱激蛋白(s HSP,Small heat shock protein)家族,其中HSP90是進(jìn)化上高度保守,分布較廣的一類熱激蛋白,在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)均有分布,占細(xì)胞總蛋白的1%～2%,當(dāng)遭遇脅迫時(shí)含量能提高4%～6%[3-4]。

HSP90蛋白在栽培番茄(Solanum lycopersicumL.)、馬鈴薯、辣椒(Capsicum annuumL.)等作物的耐熱性、抗旱性等研究中得到驗(yàn)證[5-7]。高溫脅迫后[8]:(1)HSP90 能結(jié)合折疊和變性的蛋白質(zhì),維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài);(2)HSP90能激活底物蛋白質(zhì)的活性,進(jìn)而發(fā)揮其生理功能;(3)HSP90 能抑制熱激因子(HSF,Heat shock factor)的功能,負(fù)向調(diào)控包含熱激元件(HSE,Heat shock element)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn),過表 達(dá)At HSP90.2、At HSP90.5、At HSP90.7會(huì)降低擬南芥(Arabidopsis thaliana)對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐性,但會(huì)提高其對(duì)高鈣離子的耐性,而At HSP90.2在ABA 依賴型信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[9]。Yamada 等[10]發(fā)現(xiàn),擬南芥At HSP90.2負(fù)調(diào)控?zé)嵴T導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄,熱激后At HSP90.2暫時(shí)失活,進(jìn)而激活HSF 以提高熱誘導(dǎo)基因的表達(dá)。Gil等[11]證實(shí),擬南芥HSP90.1可激活底物蛋白ZTL,進(jìn)而減少不溶性蛋白質(zhì)聚集、重新折疊錯(cuò)誤蛋白,提高植物的耐熱性。擬南芥HSP90.1 能 與ROF1 和NBR1 互 作,通 過 熱應(yīng)激記憶提高其耐熱性[12-13]。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)HSP90能激活SGT1b-TIR1蛋白復(fù)合體,通過生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制植物在高溫脅迫下的生長發(fā)育。Samakovli等[15-16]發(fā)現(xiàn),HSP90在YODA 級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的熱應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要功能,調(diào)控氣孔的形成以適應(yīng)高溫環(huán)境。過表達(dá)Os HSP50.2可提高水稻(Oryza sativaL.)對(duì)干旱、滲透脅迫的抗性,在干旱脅迫下轉(zhuǎn)化株的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、脯氨酸含量則顯著提高[17]。Xu等[18]發(fā)現(xiàn),在擬南芥過表達(dá)5個(gè)Gm HSP90s基因均可增加脯氨酸含量,提高其高溫、干旱等非生物脅迫抗性。Wei等[19]發(fā)現(xiàn),木薯(Manihot esculenta)Me HSP90.9能通過招募MeWRKY20和MeCatalase1蛋白調(diào)控木薯的抗旱性。深入研究植物HSP90基因在逆境脅迫下的功能,對(duì)于正確認(rèn)識(shí)植物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多重脅迫響應(yīng)機(jī)制及提高作物的抗逆性具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前,HSP90基因家族在作物中的非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制、表達(dá)模式及其提高作物抗逆性的機(jī)制尚不明晰,其中馬鈴薯HSP90基因家族的相關(guān)研究較少。本研究以茄科植物HSP90基因家族為研究對(duì)象,對(duì)馬鈴薯全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索,鑒定HSP90基因家族成員,明確HSP90基因家族在基因組中的分布特征和啟動(dòng)子的順式作用元件,并使用qRT-PCR 技術(shù)分析其高溫與干旱脅迫下的表達(dá)差異;構(gòu)建HSP90基因家族蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI),對(duì)HSP90伙伴蛋白的功能進(jìn)行解析,為研究馬鈴薯HSP90基因家族調(diào)控高溫干旱等逆境脅迫的重要功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的培養(yǎng)與處理方法

試驗(yàn)材料選擇對(duì)高溫干旱有較強(qiáng)耐性的馬鈴薯野生種恰克薯(Solanum chacoenseBitter),材料由隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院提供,組培苗培養(yǎng)條件為溫度22～24 ℃,光照時(shí)長12 h/d;繼代培養(yǎng)使用的是普通MS培養(yǎng)基。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理(高溫脅迫處理,干旱脅迫處理),3 次重復(fù),對(duì)照(CK)為常溫下生長的組培苗。高溫脅迫處理:將25 ℃生長5周的組培苗置入40 ℃培養(yǎng)箱中處理1 h,6 h。干旱脅迫處理:PEG 模擬水分脅迫參照鄧珍等[20]的方法,將15% PEG(PEG-8000)脅迫下生長的組培苗置入25℃生長3周;取出不同處理下的葉片,液氮速凍后-76 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 茄科植物HSP90 基因家族的鑒定

在Pfam26.0(http://pfam.xfam.org/)下載HSP90蛋白(ID:PF00183)的HMM 文件。在茄科植物基因組網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)下載12個(gè)茄科植物蛋白質(zhì)序列:栽培番茄、馬鈴薯、漸窄葉煙草(Nicotiana attenuatatorr.Ex.Watson)、辣椒、紅花煙草(Nicotiana tabacumL.)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)、腋花矮牽牛(Petunia axillaris)、矮牽牛(Petunia inflata)、潘那利番茄(Solanum pennellii)、醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)、智利番茄(Solanum chilense)、栽培茄(Solanum melongena),同時(shí)下載擬南芥HSP90蛋白質(zhì)序列。利用本地化HMMER(http://www.hmmer.org/)子程序hmmsearch從茄科植物及擬南芥蛋白質(zhì)中篩選出HSP90蛋白ID(E-value

1.3 馬鈴薯HSP90 基因家族特征分析

根據(jù)馬鈴薯基因注釋文件,利用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)進(jìn)行馬鈴薯HSP90基因家族的染色體定位。使用MEME Suite 5.1.1(http://meme-suite.org/)分析馬鈴薯HSP90蛋白的保守基序,最大保守基序數(shù)設(shè)為10,其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。用MEGA-X 構(gòu)建茄科植物HSP90家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(最大似然法,bootstrap value為1 000)。使用TBtools軟件對(duì)馬鈴薯HSP90基因家族成員在干旱脅迫和熱脅迫下的基因表達(dá)量進(jìn)行分析[21]。

1.4 HSP90 基因家族的基因結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子分析

利用PLANTCARE 軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析HSP90 家族基因啟動(dòng)子順式作用元件;使用Zhao等[22]提供的python程序分析馬鈴薯HSP90家族基因啟動(dòng)子的熱激元件HSE,使用TBtools對(duì)啟動(dòng)子功能元件進(jìn)行可視化[21]。

1.5 HSP90家族蛋白質(zhì)互作分析

為研究與HSP90家族成員發(fā)生作用的底物蛋白,使用STRING(https://string-db.org/)預(yù)測與HSP90 家族發(fā)生相互作用的功能伙伴蛋白[23],選擇score>0.9的蛋白質(zhì)作為功能伙伴蛋白,使用Bingo對(duì)功能伙伴蛋白進(jìn)行GO 富集分析(correctedP-value<0.05)。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析

采用UNIQ-10 柱式Trizol總RNA 抽提試劑盒(上海生工,B511321)提取馬鈴薯試管苗總RNA,用Maxima Reverse Transcriptase(Thermo Scientific,EP0743)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將c DNA 樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測,選擇ef1-α作為內(nèi)參基因[24],重復(fù)3次,實(shí)時(shí)定量PCR 試劑使用2X SG Fast qPCR Master Mix (High Rox,B639273,BBI),使用ABI Stepone plus型熒光定量PCR 儀(ABI,Foster,CA,USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測,引物序列見表1,其中St HSP90.2(PGSC0003DMT400014812)基因表達(dá)量過低無法正常擴(kuò)增。數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct計(jì)算樣本處理前后的相對(duì)表達(dá)量,△△Ct=(△Ct處理樣品-△Ctef1a)-(△Ct對(duì)照樣品-△Ctef1a)。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primers sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯HSP90 基因家族成員鑒定與蛋白質(zhì)基序分析

經(jīng)過hmmsearch 程序和Pfam 數(shù)據(jù)庫的篩選,去冗余后得到11 個(gè)馬鈴薯HSP90基因家族成員,對(duì)其編號(hào)(St HSP90.1～St HSP90.11);基于馬鈴薯基因組注釋文件,使用MG2C 軟件對(duì)HSP90家族成員進(jìn)行染色體定位(圖1)。

圖1 馬鈴薯HSP90 基因家族成員染色體定位Fig.1 Chromosome location of family members of potato HSP90 genes

根據(jù)遺傳連鎖圖可知,馬鈴薯St HSP90基因家族成員分布于8 條染色體上。Chr3、Chr4、Chr5、Chr8、Chr10、Chr12 染色體上各分布1 個(gè)HSP90基因家族成員,Chr7 染色體分布2 個(gè)HSP90基因家族成員,Chr6 染色體分布3 個(gè)HSP90基因家族成員;HSP90基因家族的等電點(diǎn)為4.50～9.93,分子質(zhì)量為28.53～92.74 ku(表2)。

表2 馬鈴薯HSP90 基因家族成員Table 2 Family members of potato HSP90 genes

在11個(gè)St HSP90基因中,XPASY ScanProsite(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)St HSP90基因家族成員中有8個(gè)具有PS00298 序列(Heat shock hsp90 proteins family signature),而St HSP90.1、St HSP90.2、St HSP90.10中不具有該序列。利用MEME 工具對(duì)HSP90基因家族的保守基序分析,共含有10個(gè)保守基序(圖2)。其中7個(gè)HSP90家族成員(St HSP90.3、St HSP90.4、St HSP90.5、St HSP90.6、St HSP90.7、St HSP90.8、St HSP90.11)含有完整的5 個(gè)保守基序。7 個(gè)成員中,St HSP90.4、St HSP90.6、St HSP90.8 和St HP90.11的結(jié)構(gòu)相似,St HSP90.3 和St HSP90.5 結(jié)構(gòu)相似,表明這些蛋白質(zhì)具有類似功能。11個(gè)HSP90家族成員均包含HSP90典型結(jié)構(gòu)域(PF00183),9個(gè)HSP90家族成員(St HSP90.1、St HSP90.2、St HSP90.3、St HSP90.4、St HSP90.5、St HSP90.6、St HSP90.8、St HSP90.9、St HSP90.11)同時(shí)包含2個(gè)特征結(jié)構(gòu)域(HSP90 和HATPase_c 結(jié)構(gòu)域)。

圖2 馬鈴薯HSP90 基因家族蛋白保守基序Fig.2 Family protein conserved motifs of potato HSP90 genes

2.2 HSP90 基因家族成員的順式作用元件分析

對(duì)馬鈴薯HSP90基因上游序列分析后發(fā)現(xiàn),HSP90基因普遍存在與熱脅迫相關(guān)的HSE 元件(圖3),HSE 元 件 從5～12 個(gè) 不 等;其 中St HSP90.3含 有12 個(gè)HSE 元 件,而St HSP90.5不包含HSE 元件。其次,9個(gè)基因含有1～8個(gè)與干旱響應(yīng)與脅迫響應(yīng)元件,其中St HSP90.11含有8 個(gè)STRE 元 件(stress response element),St HSP90.1有3 個(gè)干旱響應(yīng)元件,St HSP90.10含有4個(gè)干旱響應(yīng)元件。5個(gè)基因共包含7個(gè)低溫響應(yīng)元件,其中St HSP90.3含有2個(gè)低溫響應(yīng)元件(圖3)。此外,HSP90基因中包含有大量與赤霉素、脫落酸、茉莉酸、玉米素、乙烯等激素響應(yīng)元件(圖3);激素響應(yīng)元件中乙烯響應(yīng)元件最多,St HSP90.2～St HSP90.11共9 個(gè)基因包含22個(gè)乙烯響應(yīng)元件,其中St HSP90.4包含6個(gè)乙烯響應(yīng)元件;其次為茉莉酸應(yīng)答元件,St HSP90.2、St HSP90.3、St HSP90.6、St HSP90.8、St HSP90.10共5個(gè)基因包含18 個(gè)茉莉酸應(yīng)答元件,其中St HSP90.2和St HSP90.8各包含6個(gè)茉莉酸應(yīng)答元件(圖3)。St HSP90.1、St HSP90.2、St HSP90.6、St HSP90.8、St HSP90.9共包含14 個(gè)脫落酸響應(yīng)元件,其中St HSP90.1包含4 個(gè)脫落酸響應(yīng)元件。部分HSP90基因包含11 個(gè)生長素響應(yīng)元件,8個(gè)赤霉素響應(yīng)元件,4個(gè)玉米素響應(yīng)元件和3個(gè)水楊酸響應(yīng)元件(圖3)。

圖3 馬鈴薯HSP90 基因順式作用元件Fig.3 Cis-regulatory elements of potato HSP90 genes

2.3 HSP90 基因家族成員PPI網(wǎng)絡(luò)與功能伙伴蛋白注釋分析

STRING 數(shù) 據(jù) 庫 分 析 顯 示11 個(gè)HSP90 蛋白構(gòu)成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4-A,interaction score>0.700),該網(wǎng)絡(luò)有21個(gè)節(jié)點(diǎn)和130條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為12.4,PPI富集P-value

圖4 馬鈴薯HSP90 基因家族蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Integrative analysis of HSP90 protein-protein interaction(PPI)network in potato

利用STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到HSP90基因家族的22個(gè)功能伙伴蛋白(表3,score≥0.9),對(duì)這22個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO 功能富集分析,發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)過程富集可分為6大類(圖4-B):(1)蛋白質(zhì)的折疊、水解與穩(wěn)定性調(diào)節(jié)相關(guān)途徑;(2)氧水平應(yīng)答、熱激應(yīng)答于熱適應(yīng)等高溫脅迫響應(yīng)途徑;(3)脅迫應(yīng)答、鹽脅迫應(yīng)答、滲透脅迫應(yīng)答與非生物刺激等非生物脅迫途徑;(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;(5)花分生組織決定性、去黃化、營養(yǎng)期轉(zhuǎn)變和花粉管生長等生長發(fā)育途徑;(6)生物刺激應(yīng)答、真菌刺激應(yīng)答與真菌防御反應(yīng)等生物脅迫途徑。22個(gè)功能伙伴蛋白在KEGG 數(shù)據(jù)庫共注釋到植物病原菌互作(sot04626),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(sot04141),蛋白質(zhì)輸出(sot03060)和吞噬小體(sot04145)4 個(gè)通路。

表3 利用STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的與HSP90伙伴蛋白Table 3 Predicted functional partners of HSP90 using STRING database

2.4 茄科植物HSP90 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用hmmsearch從12個(gè)茄科植物中共鑒定出130個(gè)HSP90基因家族成員,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),系統(tǒng)樹顯示HSP90基因家族被分為三簇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),簇Ⅰ中有85個(gè)基因家族成員,簇Ⅱ中有33個(gè)基因家族成員,簇Ⅲ中有12個(gè)基因家族成員。簇Ⅰ中包含12個(gè)茄科植物的HSP90基因家族成員,其中的馬鈴薯HSP90家族成員與潘那利番茄、智利番茄、栽培番茄、醋栗番茄等茄科番茄屬植物的HSP90基因具有較高同源性,親緣關(guān)系較近(圖5)。簇Ⅱ中包含11個(gè)茄科植物成員(除潘那利番茄)的33 個(gè)基因家族成員,包括St HSP90.2,St HSP90.4。馬鈴薯St HSP90.2與辣椒Ca HSP90.3、栽培茄Sm HSP90.4和漸窄葉煙草Na HSP90.5具有較近的親緣關(guān)系;馬鈴薯St HSP90.4與智利番茄Sc HSP90.4栽培番茄Sl-HP90.4和醋栗番茄Spi HSP90.4具有較近的親緣關(guān)系。St HSP90.2和St HSP90.4與紅花煙草、本氏煙草、矮牽牛、腋花矮牽牛的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。簇Ⅲ包括9個(gè)茄科植物(馬鈴薯、潘那利番茄、醋栗番、栽培番茄、智利番茄、矮牽牛、紅花煙草、本氏煙草、漸窄葉煙草)的12個(gè)基因家族成員,其中馬鈴薯St HSP90.3與智利番茄Sc HSP90.3,栽培番茄Sl HP90.3,醋栗番茄Spi HSP90.3和潘那利番茄Sp HSP90.3的同源性較高,但是與漸窄葉煙草、紅花煙草、本氏煙草的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 茄科植物HSP90 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of HSP90 gene family in Solanaceae plants

2.5 馬鈴薯HSP90 基因家族成員的qRT-PCR分析

采用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)馬鈴薯HSP90基因家族成員在高溫、干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,高溫脅迫后,10個(gè)馬鈴薯HSP90基因的表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(圖6)。僅St HSP90.2(PGSC0003DMT400014812)基因的表達(dá)量過低無法正常擴(kuò)增。6個(gè)基因呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,其中4 個(gè)基因的表達(dá)量極高:St HSP90.9(PGSC0003DMT400074374)在脅迫1 h后上調(diào)至4 190倍,6 h后降至1 621倍;St HSP90.10(PGSC00003DMT400074377)上調(diào)2 800 倍,在6 h后降低至1 429 倍;St HSP90.1(PGSC00003 DMT400014217)上調(diào)2 139倍,6 h后降至1 126倍;St HSP90.4(PGSC0003DMT 400024594)上調(diào)1 090 倍,6 h 后 降 至468 倍。St HSP90.3(PGSC0003DMT400015734),St HSP90.5(PGSC 0003DMT400025743),St HSP90.7(PGSC0003DMT400050556)和St HSP90.8(PGSC0003DMT400057003)4個(gè)基因在高溫脅迫1～6 h時(shí)呈現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的表達(dá)趨勢;只有St HSP90.8(PGSC0003DMT400057003)僅上調(diào)1.5 倍。在干旱脅迫3 周后,與對(duì)照相比僅St HSP90.11(PGSC0003DMT400076601)表達(dá)量略有下降,其余9個(gè)馬鈴薯HSP90基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢,上調(diào)幅度為1.1～2.5倍,其表達(dá)量明顯小于高溫脅迫下的基因表達(dá)量(圖7)。其中St HSP90.4(PGSC0003DMT400024594)表達(dá)量最高,上調(diào)2.5倍,St HSP90.1(PGSC0003DMT400014217)和St HSP90.10(PGSC0003DMT400074377)上調(diào)1.6倍,St HSP90.9(PGSC0003DMT400074374)上調(diào)1.5倍,其余5個(gè)HSP90基因上調(diào)幅度均小于1.5倍。

圖6 馬鈴薯HSP90 基因家族成員基因在高溫脅迫下的qRT-PCR 分析Fig.6 q RT-PCR analysis of HSP90 in potato under high temperature stress

圖7 馬薯HSP90 基因家族成員基因在干旱脅迫下的qRT-PCR 分析Fig.7 qRT-PCR analysis of HSP90 in potato under drought stress

3 討論

HSP90基因家族在進(jìn)化過程中高度保守,在遭受非生物脅迫時(shí)能被激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的新陳代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。本研究從茄科植物中鑒定出130個(gè)HSP90基因,在馬鈴薯基因組中鑒定出11個(gè)HSP90基因,其在染色體上的分布規(guī)律與番茄、辣椒HSP90相似[5,7]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示HSP90基因進(jìn)化上高度保守,12 個(gè)茄科植物的130個(gè)HSP90基因分為3簇,與水稻和辣椒相同;馬鈴薯HSP90基因家族與潘那利番茄、智利番茄、栽培番茄等番茄屬植物親緣關(guān)系較近。7個(gè)馬鈴薯HSP90家族成員具有10個(gè)蛋白保守基序,且位置相對(duì)一致;所有HSP90家族成員均包含PF00183 結(jié) 構(gòu) 域,9 個(gè)HSP90 家 族 成 員 包 含HSP90和HATPase_c結(jié)構(gòu)域。

植物啟動(dòng)子順式作用元件決定基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄效率,能調(diào)控下游基因的表達(dá)。熱激因子HSF能感受多途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱信號(hào),識(shí)別并結(jié)合HSE 元件[25],通過熱激啟動(dòng)子(Heat shock promoter)促進(jìn)熱脅迫基因表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯HSP90基因家族普遍存在HSE元件,位置和數(shù)量分布存在差異;St HSP90.5未發(fā)現(xiàn)HSE元件,熱激后St HSP90.5僅上調(diào)1.5倍,而其他HSP90基因熱脅迫后發(fā)生不同程度的上調(diào),這與HSE 元件分布的位置及結(jié)構(gòu)不同相關(guān);Zhao等[22]發(fā)現(xiàn),不同類型和結(jié)構(gòu)的HSE 元件,序列變異和位點(diǎn)錯(cuò)配的HSE 元件均會(huì)影響下游基因轉(zhuǎn)錄效率,這與本研究結(jié)果一致。除HSE元件之外,馬鈴薯HSP90基因存在干旱響應(yīng)元件、STRE 元件、低溫響應(yīng)元件等脅迫響應(yīng)元件,表明馬鈴薯HSP90基因參與多重脅迫抗性調(diào)控。研究表明[27-28],植物HSP 蛋白/伙伴蛋白受干旱脅迫、激素信號(hào)誘導(dǎo),且乙烯信號(hào)通路也是植物響應(yīng)干旱脅迫的重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn),長期干旱脅迫后多數(shù)馬鈴薯HSP90基因明顯上調(diào),其中St HSP90.4上調(diào)2.5倍;除St HSP90.1外其余馬鈴薯HSP90基因均包含乙烯響應(yīng)元件,而St HSP90.4包含6 個(gè)乙烯響應(yīng)元件,這表明馬鈴薯HSP90基因通過乙烯信號(hào)通路參與干旱脅迫調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯HSP90基因非編碼區(qū)包含生長素、茉莉酸、脫落酸、乙烯等激素響應(yīng)順式元件,受相應(yīng)激素信號(hào)途徑調(diào)控;這與前人研究結(jié)果類似,植物HSP90 蛋白通過生長素信號(hào)途徑[29]、茉 莉 酸 信 號(hào) 途 徑[30]、ABA 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通路[31]與乙烯信號(hào)通路[32-33]調(diào)控逆境脅迫。綜上所述,馬鈴薯HSP90基因啟動(dòng)子受多種激素信號(hào)調(diào)控,預(yù)示馬鈴薯HSP90基因通過激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路應(yīng)對(duì)逆境脅迫。

HSP90蛋白能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)調(diào)控植物生理生化過程,能與HSP70及其他蛋白發(fā)生作用,進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)的折疊[34]。本研究證實(shí)BIP 蛋白屬于HSP70家族,是馬鈴薯HSP90基因家族PPI網(wǎng)絡(luò)的中心蛋白。研究表明[35-36],BIP 蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用,在未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)中促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊,緩解非生物脅迫引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷,過表達(dá)BIP基因的大豆表現(xiàn)出較強(qiáng)抗旱性。本研究中,高溫與干旱脅迫后多數(shù)馬鈴薯HSP90基因明顯上調(diào),馬鈴薯HSP90 家族蛋白均與BIP 蛋白發(fā)生互作,高溫干旱脅迫下高表達(dá)基因St HSP90.5與BIP蛋白有極強(qiáng)的互作關(guān)系(score>0.9),說明該HSP90-BIP復(fù)合體能調(diào)控UPR 反應(yīng),在抵抗極端逆境引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫中發(fā)揮重要作用。目前,植物中已發(fā)現(xiàn)上百種蛋白質(zhì)受HSP90蛋白質(zhì)調(diào)控,通過HSP90伙伴蛋白質(zhì)復(fù)合體參與逆境脅迫應(yīng)答、生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程[8,29,37]。馬 鈴 薯St HSP9.6、St HSP90.8和St HSP9.11在高溫或干旱脅迫下表達(dá)量較高,這3個(gè)HSP90基因的伙伴蛋白CHIP(PGSC0003-DMT400051983)與擬南芥E3 泛素連接酶At-CHIP高度同源;Zhou等[38]發(fā)現(xiàn)AtCHIP蛋白通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解高溫等脅迫產(chǎn)生的錯(cuò)誤折疊蛋白,這表明馬鈴薯HSP90蛋白調(diào)控毒蛋白降解通路,在高溫等逆境脅迫具有重要功能。Pant等[39]發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫下,擬南芥CPN60ATPXL1蛋白復(fù)合體通過激活NADP-蘋果酸脫氫酶活性抑制ROS形成,進(jìn)而提高其耐熱性和抗病性;而馬鈴薯St HSP90.7伙伴蛋白CPN60A(PGSC0003DMT400002933)與擬南芥CPN60A 蛋白高度同源,且St HSP9.7在高溫與干旱脅迫后表達(dá)量較高,說明St HSP90.7在高溫或干旱脅迫過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯HSP90蛋白與其伙伴蛋白構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的逆境脅迫網(wǎng)絡(luò),鑒定的HSP90-伙伴蛋白復(fù)合體在高溫、干旱等逆境脅迫下發(fā)揮重要作用,但需要進(jìn)一步使用酵母雙雜交技術(shù)、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)對(duì) HSP90-BIP、HSP90-CHIP與HSP90-CPN60A 蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系進(jìn)行充分驗(yàn)證,從而為提高馬鈴薯的多重脅迫抗性和培育抗旱耐熱型品種提供新途徑。