整合素連接激酶在草酸鈣晶體誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中的作用

李彩霞， 李 元

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，銀川 750004； 2.甘肅省人民醫(yī)院中心實驗室，蘭州 730000）

腎結(jié)石是泌尿外科的一種常見疾病，它在全球的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高。它的形成涉及草酸鈣晶體的成核、生長、聚集、滯留等過程[1]。草酸鈣的主要成分為一水草酸鈣（COM）和二水草酸鈣（COD），研究發(fā)現(xiàn)，腎臟中過量的草酸鈣會引起腎小管上皮細(xì)胞的損傷[2]以及誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT），加重腎結(jié)石患者的疾病進(jìn)程[3]。EMT 發(fā)生過程中，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞，引起細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑，而腎臟中ECM 重塑與膠原含量的變化以及和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）的動態(tài)平衡[4]有關(guān)。

整合素連接激酶（ILK）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶[5]。ILK 的異常表達(dá)與腎細(xì)胞癌[6]、腎小管間質(zhì)纖維化[7]、糖尿病腎小球病變和先天性腎病綜合征有關(guān)。Huang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，去除小鼠腎皮質(zhì)集合管主細(xì)胞中的ILK，導(dǎo)致腎臟嚴(yán)重炎癥和間質(zhì)纖維化，ILK 表達(dá)量的變化在腎小管上皮細(xì)胞病變中扮演重要的角色。根據(jù)以上研究草酸鈣能夠誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生并引起ECM 重塑，而ILK和腎臟疾病有著密切的關(guān)聯(lián)。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)腎結(jié)石疾病與ILK 之間是否存在關(guān)系的報道，本實驗通過將HK-2 細(xì)胞暴露于COM 中，初步探討ILK 在COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞EMT 中的作用，為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要材料

HK-2 細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫購買，產(chǎn)品編號：BNCC295668）；CCK-8 試劑盒和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；ILK、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和β-actin 引物由Invitrogen 公司合成；Western blot所用α-SMA（GTX100034）、COL1A1（GTX112731）、Fibronectin（GTX1000516）、Vimentin（GTX100619）和TIMP-1（GTX108254）均購自Gene Tex 公司；ILK（12955-1-AP）、MMP-2（10373-2-AP）、MMP-9（10375-2-AP）和β-Actin（23660-1-AP）均購自Proteintech 公司；E-cadherin（#3195）購自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2 細(xì)胞用含10%的胎牛血清（FBS）、DMEM 和Ham′F12 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長融合度為80%～90%時，PBS 清洗2 次，使用胰酶消化并按1∶3 傳代。

1.2.2 CCK-8 實驗檢測HK-2 細(xì)胞存活率 HK-2 細(xì)胞接種到96 孔板中，分為空白對照（NC）組、COM 組（6、24 和48 h）共4 組，每組設(shè)3 個平行復(fù)孔，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，在生化孵箱中孵育1 h 后在450 nm 吸光度檢測，計算HK-2細(xì)胞的存活率。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 各組細(xì)胞中加入1 mL Trizol 裂解液裂解細(xì)胞，根據(jù)RNA 提取試劑盒操作說明提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)試劑盒說明將cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：1）預(yù)變性：95 ℃2 min；2）變性：95 ℃15 s；3）退火/延伸：60 ℃15～30 s；4）重復(fù)步驟變性和退火/延伸：總共40 個循環(huán)；5）熔解曲線分析：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，見表1。

表1 引物名稱、序列及產(chǎn)物長度

1.2.4 Western blot 檢測EMT 和ECM 相關(guān)蛋白和ILK 蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞用PBS 洗滌3次，提取蛋白，用Bradford 法測定蛋白濃度。本實驗中Western blot 使用的一抗分別為兔抗βactin（1∶1 000）、兔抗α-SMA（1∶1 000）、兔抗Vimentin（1∶2 000）、兔抗E-cadherin（1∶1 000）、兔抗COL1A1（1∶1 000）、兔抗Fibronectin（1∶1 000）、兔抗MMP-2（1∶1 000）、兔抗MMP-9（1∶1 000）、兔抗ILK（1∶1 000）、兔抗TIMP-1（1∶1 000）；二抗?jié)舛葹?∶4 000。凝膠成像儀采集圖像，以目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值評價蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本比較采用Dunnett-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COM 對HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響

NC 組中HK-2 細(xì)胞呈圓形或者卵圓形，大小均一，細(xì)胞間連接緊密，融合后呈鵝卵石樣。COM 組中，HK-2 細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，大小不一，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞變形嚴(yán)重且連接較松散，隨著HK-2 細(xì)胞暴露于COM中時間的延長，大多數(shù)HK-2 細(xì)胞表現(xiàn)為長條形及梭形，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察200 μg·mL-1 COM 對HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

2.2 COM 抑制HK-2 細(xì)胞的生長

CCK-8 結(jié)果顯示，與NC 組比較，HK-2 細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 時細(xì)胞存活率均降低（P 均＜0.01），COM 呈時間依賴性抑制HK-2 細(xì)胞的增殖活性，見圖2。

圖2 CCK-8 檢測200 μg·mL-1 COM 對HK-2 細(xì)胞存活率的影響

2.3 COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞EMT 蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組比較，HK-2細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 時Vimentin 和α-SMA 的蛋白表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），Vimentin 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞增，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞減（P 均＜0.01），見圖3。

圖3 Western blot 檢測HK-2 細(xì)胞Vimentin、E-cadherin 和α-SMA 蛋白的表達(dá)

2.4 COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞ECM 蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組比較，HK-2細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 時COL1A1 和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平升高（P 均＜0.01），COL1A1 和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞增（P 均＜0.01），見圖4。

圖4 Western blot 檢測HK-2 細(xì)胞COL1A1 和Fibronectin 蛋白的表達(dá)

2.5 COM 對HK-2 細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表達(dá)水平的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與NC 組比較，HK-2 細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6 h 時MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05），在24 和48 h時，MMP-2 和MMP-9 的mRNA 表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01），TIMP-1的mRNA 表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01），MMP-2和MMP-9 的mRNA 表達(dá)水平呈時間依賴性遞減，TIMP-1 的mRNA 表達(dá)水平呈時間依賴性遞增（P 均＜0.01），見圖5。

圖5 qRT-PCR 檢測HK-2 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 相對表達(dá)水平

2.6 COM 對HK-2 細(xì) 胞MMP-2、MM P-9 和TIMP-1 的蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組比較，HK-2細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24 和48 h 時MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01），TIMP-1 蛋白表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01），MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞減，TIMP-1 蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞增（P 均＜0.01），見圖6。

圖6 Western blot 檢測HK-2 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 蛋白的表達(dá)

2.7 ILK 在COM 誘導(dǎo)的EMT 中的表達(dá)

qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與NC組比較，HK-2 細(xì)胞暴露于200 μg·mL-1COM 6、24和48 h 時ILK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高（P 均<0.01），ILK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞增（P 均＜0.01），見圖7。

圖7 Western blot 檢測HK-2 細(xì)胞ILK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平

3 討論

腎結(jié)石是一種復(fù)雜的疾病，影響其形成的因素眾多，在發(fā)達(dá)國家其發(fā)病率高達(dá)14%[9]。結(jié)石的成分復(fù)雜，大約80%由草酸鈣組成[10]。腎小管細(xì)胞暴露在草酸鈣晶體中會導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，細(xì)胞的損傷為結(jié)石的黏附形成提供了位點(diǎn)且促進(jìn)草酸鈣晶體在腎臟中的沉積。本實驗結(jié)果顯示，正常的HK-2 細(xì)胞大多數(shù)為圓形或者鵝卵石樣。COM 作用于HK-2 細(xì)胞后，HK-2 細(xì)胞變形嚴(yán)重，其形態(tài)變?yōu)殚L梭形，形成纖維細(xì)胞樣外觀，CCK-8 實驗結(jié)果顯示，COM 抑制HK-2 細(xì)胞的生長，HK-2 細(xì)胞存活率明顯下降，以上結(jié)果說明COM對HK-2 細(xì)胞具有損傷作用，本實驗結(jié)果與有關(guān)報道[11]一致。

草酸鈣晶體可通過激活TGF-β1/Smads 途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[12]。EMT 過程中，上皮細(xì)胞失去上皮極性及細(xì)胞間連接，E-cadherin 等發(fā)生下調(diào)及Fibronectin、Snail 等出現(xiàn)上調(diào)[13]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK-2 細(xì)胞暴露于COM中，E-cadherin 表達(dá)下降，α-SMA 和Vimentin 表達(dá)上升，HK-2 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由鵝卵石狀變?yōu)殚L梭形，表明COM 誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。EMT發(fā)生過程中破壞腎小管基底膜轉(zhuǎn)，分泌Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原，其中又以Ⅲ型膠原含量最為豐富，EMT 先前被認(rèn)為是組織纖維化中ECM 相關(guān)蛋白的主要來源。有研究[14-15]表明，大多數(shù)腎臟疾病均表現(xiàn)ECM 沉積，引起腎臟功能的失常。草酸鈣晶體作用于腎小管上皮細(xì)胞會引起TGF-β1/Smads等途徑的激活，造成ECM 代謝異常。生理條件下，ECM 的產(chǎn)生和降解是平衡的，ECM 的降解主要受到MMPs 及TIMPs 的調(diào)控，MMPs 活性的變化以及數(shù)量決定ECM 重構(gòu)。在腎臟中，MMP-2和MMP-9 主要在腎基質(zhì)中表達(dá)，其功能作用是對腎臟中Ⅳ型膠原進(jìn)行分解代謝[16]，維持腎臟中ECM 的穩(wěn)定。TIMP-1 是重要的纖維化因子，通過與MMP-9 結(jié)合抑制ECM 的降解，其表達(dá)量的升高與疾病的發(fā)展呈正相關(guān)。本研究檢測ECM 相關(guān)成分COL1A1 和Fibronectin 以及與ECM 代謝相關(guān)的酶，結(jié)果顯示，COM 組中COL1A1 和Fibronectin表達(dá)水平升高，24、48 h MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平下降，TIMP-1 表達(dá)水平上升，表明COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞發(fā)生EMT 和ECM 堆積，引起HK-2細(xì)胞內(nèi)發(fā)生ECM 重塑，與有關(guān)報道[17]一致，為研究ILK 在HK-2 細(xì)胞暴露于COM 中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

ILK 是一種重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子[18]。近年來有研究[19]顯示，ILK 在EMT 發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，Zheng 等[20]發(fā)現(xiàn)將ILK 基因敲除后，能夠抑制EMT 過程降低細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，ILK 在ECM 的重塑中起著不可或缺的作用，它誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生，同時上調(diào)Fibronectin 基質(zhì)組裝和下調(diào)E-cadherin 表達(dá)，引起了ECM 大量聚集。本實驗結(jié)果表明COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞發(fā)生EMT，引起HK-2 細(xì)胞發(fā)生ECM 重塑。進(jìn)一步檢測ILK 在HK-2 細(xì)胞中表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)，隨著HK-2 細(xì)胞暴露于COM 中時間的延長，ILK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性遞增，提示ILK 可能參與COM 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞EMT 改變。

綜上所述，本實驗結(jié)果證實ILK 在HK-2 細(xì)胞暴露于COM 中表達(dá)增高，提示ILK 可能參與COM 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞的EMT 的發(fā)生，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。