抗生素早期慢暴露對大鼠成年后腸-腦軸的影響

張 準(zhǔn)， 張亞文， 劉印明， 田建英

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

哺乳動物腸道含有大量的菌群，在營養(yǎng)、代謝、抵御病原體和免疫系統(tǒng)的發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。腸道微生物群的定植影響哺乳動物的大腦發(fā)育和成年后的神經(jīng)行為。認(rèn)知功能也受腸道菌群動態(tài)變化的影響[1]。在無菌小鼠體內(nèi)，突觸素和PSD-95 表達(dá)水平變化，神經(jīng)興奮性改變，焦慮行為異常[2]。在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，無菌小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-a-drenal axis，HPA）失衡，神經(jīng)內(nèi)分泌活動異常[3]，大腦海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)改變[4]。由于胃腸系統(tǒng)的物質(zhì)運輸特征，腸道細(xì)菌群對抗生素特別敏感[5]?？股乜梢愿淖兡c道群落，即使?jié)舛冗h(yuǎn)低于致死劑量[6]。

目前，畜禽養(yǎng)殖場使用抗生素十分普遍[7]，抗生素環(huán)境殘留已經(jīng)成為威肋人類健康和生態(tài)環(huán)境安全的重要公共衛(wèi)生問題。地表水和沉積物中可檢出喹諾酮類（QNs）、大環(huán)內(nèi)酯類（MLs）和四環(huán)素類（TCs）抗生素；耕地土壤中檢測到QNs 和TCs；魚類和蔬菜植物中檢出了QNs[8]。動物源性食物中也殘留抗生素。人們通過進(jìn)食和飲用水，不可避免地長期暴露于環(huán)境抗生素，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，危害人體健康。研究[9]證實，腸道菌群失調(diào)與精神障礙的發(fā)生有關(guān)?？股厥欠駮δc-腦軸、海馬發(fā)育產(chǎn)生影響，目前尚不清楚。本研究擬觀察大鼠生命早期慢性暴露于環(huán)境中普遍存留的抗生素，對其成年后腸道菌群結(jié)構(gòu)、海馬形態(tài)和功能的影響，以探討抗生素對腸-腦軸的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與分組

Morris 水迷宮、Water Maze 處理軟件（北京碩林苑科技有限公司），RM2235 石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6 及IL-1β ELISA 檢測試劑盒（中國萬類生物公司）。

選取16 只出生后第21 天（PND21）、體質(zhì)量50～55 g 的SD 雄性大鼠，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（批號：10752309201900100）。隨機(jī)分為對照組（Con）和抗生素組（Abx）。Con 組大鼠一直飲用無菌水；Abx 組大鼠依次在無菌水中添加鹽酸四環(huán)素（3 周，2 g·L-1）、羅紅霉素（1 周，0.005 g·L-1）和鹽酸環(huán)丙沙星（6 周，0.1 g·L-1）。10 周后，收集大鼠糞便，-80℃保存，行Morris 水迷宮行為測試。結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行麻醉，取血清，-80℃保存，取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，并進(jìn)行HE 染色。

1.2 實驗方法

1.2.1 Morris 水迷宮實驗 對大鼠進(jìn)行定位航行實驗，前4 d 進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練；第5 天觀察其空間記憶能力；第6 天行空間探索實驗，觀察大鼠對空間位置記憶的保持能力。評價指標(biāo)：逃逸潛伏期、穿越原平臺次數(shù)。

1.2.2 16SrDNA 測序技術(shù) 糞菌樣本經(jīng)蛋白酶K 酶解、離心、HiBind 柱子洗脫，提取DNA。對提取的DNA 的16SrDNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，序列測定。細(xì)菌16SrDNA V3-V4 區(qū)域通用引物：341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。經(jīng)數(shù)據(jù)拆分、數(shù)據(jù)拼接和過濾、DADA2 去噪后，對菌群多樣性進(jìn)行生物信息分析。

1.2.3 ELISA 法檢測血清炎性因子水平 具體步驟均按照ELISA 試劑盒說明書操作。

1.2.4 海馬組織HE 染色 行為學(xué)實驗結(jié)束后，對大鼠10%水合氯醛麻醉，開胸暴露心臟，于左心尖處刺入灌流針，剪開右心耳，PBS 緩沖液灌流沖洗干凈后，4%多聚甲醛灌流固定，取腦，置于4%多聚甲醛中過夜。取大鼠海馬區(qū)腦組織石蠟包埋，冠狀切片，厚度5 μm，HE 染色，放置光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用兩獨立樣本比較的t 檢驗；若兩組數(shù)據(jù)中，有一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或兩組數(shù)據(jù)方差不齊，組間比較采用Mann-whitney U 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實驗觀察

第10 周后，Abx 組大鼠逃逸潛伏期較對照組延長（P＜0.05），見圖1。

圖1 抗生素早期慢性暴露對大鼠成年后空間記憶能力的影響（n=7）

2.2 腸道菌群分析

2.2.1 Alpha 多樣性檢測 為評估腸道菌群的群落多樣性，進(jìn)行了Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分析。各樣本Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)的稀釋曲線趨于平坦，測序數(shù)量飽和（圖2）。結(jié)果顯示，與Con 組相比，Abx組Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均降低（P 均＜0.01），見表1。

圖2 Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)稀釋曲線

表1 兩組大鼠腸道菌群的Alpha 多樣性比較（n=7）

2.2.2 菌群相對豐度比較 在門水平上，與Con組相比，Abx 組厚壁菌門（Firmicutes）減少，疣微菌門（Verrucomicrobia）增多（P 均＜0.01），見表2、圖3；在屬水平上，與Con 相比，Abx 組乳桿菌屬（Lactobacillus）、Ruminococcaceae_UCG-005 減少，艾克曼菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）增多（P 均＜0.01），見表3、圖4；Con 組與Abx 組均有序列劃入相同的OUT 中，共有300 個相同的OUT（圖5）。

圖5 韋恩圖

表2 門水平不同菌群（前4 個）的平均相對豐度（%）

圖3 門水平不同菌群相對豐度

表3 屬水平不同菌群（前5 個）的平均相對豐度（%）

圖4 屬水平不同菌群相對豐度

2.3 血清炎性因子的變化

與Con 組比較，Abx 組大鼠血清中的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的濃度均升高（P 均＜0.01），見表4。

表4 大鼠血清中炎性因子表達(dá)水平的變化（pg·mL-1）

2.4 海馬組織形態(tài)變化

抗生素暴露10 周后，光鏡下顯示Con 組大鼠海馬組織細(xì)胞輪廓清晰、排列整齊；Abx 組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)松散，齒狀回的閂區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)排列疏松紊亂、可見核固縮，見圖6。

圖6 抗生素慢性暴露對海馬組織形態(tài)的影響（n=3）

3 討論

腸道菌群對人體免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)等生理作用的發(fā)揮以及許多疾病的發(fā)生都有十分重要的作用?？股厮幬锏氖褂貌划?dāng)會引起腸道微生物群落組成的大幅度、持久的改變和疾病的發(fā)生。生命早期使用抗生素可能與過敏、肥胖等疾病的發(fā)生有關(guān)[10]。

抗生素的使用會破壞腸道菌群的平衡。恩諾沙星處理的腸道革蘭陽性厚壁菌數(shù)量增加，革蘭陰性擬桿菌、蛋白質(zhì)細(xì)菌和疣狀芽胞桿菌數(shù)量減少[11]?；旌蠌V譜抗生素處理的新生小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)降低[12]。環(huán)丙沙星（Cip）可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和損害線粒體功能[13]。頭孢曲松能改變腸道菌群，補(bǔ)充益生菌、乳酸桿菌可以通過穩(wěn)定腸道菌群來減輕抗生素的副反應(yīng)[14]。長期應(yīng)用廣譜抗生素引起擬桿菌增多，能導(dǎo)致內(nèi)源性感染。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星前后依次暴露可致大鼠腸道厚壁菌門、乳桿菌屬、Ruminococcaceae_UCG-005 減少，擬桿菌屬等條件致病菌增多，Abx 組內(nèi)各樣本間菌群表現(xiàn)出較高的相似性，表明抗生素慢性暴露可導(dǎo)致大鼠腸道菌群多樣性的改變，引起腸道微生態(tài)失調(diào)。

抗生素暴露引起的腸道細(xì)菌構(gòu)成和數(shù)量呈時間依賴性，可啟動自噬、免疫失調(diào)和內(nèi)臟超敏反應(yīng)，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有長遠(yuǎn)影響[15]。腸道菌群紊亂還可促進(jìn)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變[16]。生命初期是神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育快速期，也是腸道菌群定植、微生態(tài)平衡形成的關(guān)鍵時期，腸道菌群在腦疾病發(fā)展中的作用應(yīng)受到重視[17]。

腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可引起腸-腦軸功能紊亂，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。缺乏正常菌群的小鼠可表現(xiàn)出焦慮及抑郁樣行為增加。無菌小鼠認(rèn)知功能發(fā)育異常[18]。出生21 d 混合抗生素暴露，可影響成年雄性BALB/c 小鼠腸道菌群組成和神經(jīng)行為[17]。Fr?hlich 等[19]發(fā)現(xiàn)混合廣譜抗生素處理的新生小鼠，腸道菌群多樣性指數(shù)降低，海馬區(qū)γ-氨基丁酸A 型受體α1 亞型mRNA 升高，表明生命早期使用抗生素引起的腸道菌群紊亂，能對小鼠的腦部功能發(fā)育產(chǎn)生不良影響[12]，也說明腸-腦軸、腸道菌群穩(wěn)態(tài)在生命早期神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育中發(fā)揮不可替代的作用。

環(huán)境中存留的鹽酸四環(huán)素和羅紅霉素均不能通過血腦屏障，環(huán)丙沙星可降低菌群多樣性[5]?；诖耍狙芯磕M生態(tài)模式，使幼鼠依次暴露于環(huán)境中普遍存在的鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素和鹽酸環(huán)丙沙星。10 周后，抗生素組Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均低于對照組，表明菌群群落多樣性降低。Desbonnet 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素引起腸道菌群多樣性及豐富度下降可致小鼠BDNF 表達(dá)量降低，是導(dǎo)致其認(rèn)知障礙的一個重要原因。本研究結(jié)果也證實，抗生素組大鼠逃逸潛伏期延長，海馬組織結(jié)構(gòu)松散，齒狀回的閂區(qū)神經(jīng)元可見核固縮，表明幼年抗生素持續(xù)暴露可損害腸-腦軸途徑，致成年后的空間記憶能力下降。

植物乳桿菌在腸道內(nèi)的下降與認(rèn)知障礙有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，抗生素組乳桿菌屬水平降低。Anisimova 等[20]結(jié)果顯示，90%的乳酸桿菌對克林霉素敏感，95%的菌株對四環(huán)素、紅霉素和利福平敏感。美金剛聯(lián)合植物乳桿菌治療12 周可改善認(rèn)知功能惡化，降低海馬區(qū)Aβ 水平，保護(hù)神經(jīng)元的完整性和可塑性[21]。本研究中擬桿菌屬等條件致病菌增多，血清中的炎性因子TNFα、IL-6、IL-1β 水平升高，表明腸道菌群失調(diào)可影響大腦認(rèn)知功能，可能與損害腸-腦軸的免疫途徑有關(guān)。

綜上所述，抗生素生命早期暴露對大腦發(fā)育及成年后的神經(jīng)行為產(chǎn)生的重大影響，可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變、海馬神經(jīng)發(fā)生不足有關(guān)。