PT2399 通過(guò)抑制HIF-2α 對(duì)小鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用

周 永， 馮罡寧， 丁 冬， 胡學(xué)宇， 燕江波， 唐志群， 金群華

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的無(wú)菌性炎癥，多發(fā)生在膝關(guān)節(jié)[1]。全世界至少有3 億人患有OA[2]。目前各種治療手段均無(wú)法有效阻止OA 的惡化。OA 涉及多種關(guān)節(jié)內(nèi)的組織和細(xì)胞，由于其主要病變部位位于軟骨，所以軟骨一直是OA 研究的重點(diǎn)[3]。關(guān)節(jié)軟骨是一種缺少血管和神經(jīng)分布的結(jié)締組織[4]，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞長(zhǎng)期處于氧缺乏的內(nèi)環(huán)境，其環(huán)境氧含量自軟骨表面由淺及深逐漸降低[5]。而軟骨細(xì)胞的氧源于關(guān)節(jié)液和血管豐富的軟骨下骨[6]。

HIF 蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，是細(xì)胞響應(yīng)缺氧的關(guān)鍵因子。HIF 蛋白由α 和β 亞基兩部分組成。HIF 蛋白家族共有3 個(gè)成員：HIF-1、HIF-2和HIF-3。HIF 蛋白α 亞基在正常含氧情況下可以被脯氨酰羥化酶羥基化，最終導(dǎo)致了HIF-α降解[7]。在氧含量低的情況下，HIF-α 不易被羥基化，易與β 亞基形成異二聚體后在細(xì)胞質(zhì)中蓄積，進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游靶向基因而發(fā)揮作用[8]。研究[9]表明，缺氧在軟骨細(xì)胞中起著兩方面作用：一方面HIF-1α 對(duì)維護(hù)關(guān)節(jié)軟骨起著保護(hù)作用，其具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制runx2 和Wnt 的作用。另一方面，在前炎性細(xì)胞因子的存在下，HIF-2α 則對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)具有破壞作用，并會(huì)增強(qiáng)VEGF、MMP13 和某些異常膠原的表達(dá)。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在Wnt 信號(hào)通路中是一種關(guān)鍵分子，分布于軟骨組織細(xì)胞內(nèi)[10]。β-catenin 信號(hào)通路的激活在軟骨增生與成長(zhǎng)中有不可取代的作用，但其在某些病理情況下被過(guò)度激活可能導(dǎo)致軟骨退變和OA 形成[11]。PT2399是一種高效的、選擇性的HIF-2α 的拮抗劑，能直接結(jié)合HIF-2α 的PASB 結(jié)構(gòu)域。透明細(xì)胞腎癌是以pVHL 失活為特征的細(xì)胞惡性增殖[12-13]，而PT2399 在人透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞中分離了HIF-2α/HIF-1β 形成的異源性二聚體[14]，使得HIF-2α的生物學(xué)作用被抑制，因此PT2399 因?qū)IF-2α產(chǎn)生的拮抗作用而具有高效的體內(nèi)抗腫瘤活性。然而PT2399 能否通過(guò)抑制HIF-2α 來(lái)延緩OA的發(fā)展尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)OA 小鼠注射HIF-2α 抑制劑PT2399 來(lái)探究HIF-2α 在OA 中的作用，并探究HIF-2α 是否通過(guò)β-catenin 對(duì)OA 產(chǎn)生作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇30 只雄性C57BL/6 小鼠（購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：IACUC-NYLAC-2020-147），8 周齡（體質(zhì)量：18～20 g），分為3 組：不進(jìn)行處理（對(duì)照組）、行內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus，DMM）造模（模型組）、DMM 建模后PT2399 治療組（治療組），每組10 只。小鼠處于22 ℃和（60±5）%的濕度，12 h 光/暗周期環(huán)境，可以自由活動(dòng)并獲取食物和水。模型手術(shù)部位為小鼠的右膝關(guān)節(jié)，治療組小鼠在造模后每天進(jìn)行腹腔注射PT2399（30 mg/100 g）。

1.2 材料

PT2399 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；組織固定液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、番紅O 固綠液體染色劑、伊紅染液、蘇木素染液、10%EDTA 脫鈣液購(gòu)自武漢Servicebio 公司；PV-9001 二抗試劑盒購(gòu)自南京中杉金橋公司；兔源HIF-2α 抗體、β-catenin、Ⅱ型膠原抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）抗體和山羊抗兔IgGH&L 均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；小量組織全RNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)愛(ài)思進(jìn)公司；一步法cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；抗熒光衰減封片劑購(gòu)自上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 組織處理 治療8 周后處死3 組小鼠。取右膝關(guān)節(jié)新鮮標(biāo)本，將標(biāo)本置于4%多聚甲醛液中固定，使用PBS 多次沖洗，置于10%EDTA 脫鈣液中脫鈣，每天換液1 次。成功脫鈣后，使用蠟塊包埋。將蠟塊置于冰臺(tái)上3～5 min 后將其切成厚度為4 μm 冠狀位切片，置于37 ℃水浴，使用載玻片撈片后，于烤片機(jī)上（60 ℃）烤干，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 番紅O 固綠和HE 染色觀察分析小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的病理改變 將組織切片置于60 ℃烤片機(jī)中30 min，二甲苯2 次脫蠟，然后在梯度乙醇溶液中進(jìn)行水化，蘇木素染色4 min，0.5%鹽酸乙醇溶液分化5 s，返藍(lán)15 min。使用0.3%固綠染色4 min，1%醋酸沖洗5 s，0.15%番紅染色4 min，最后使用梯度上升的乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在HE 染色實(shí)驗(yàn)中，將組織切片烘干、脫蠟、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、沖洗、封片。在400 倍光鏡下觀察軟骨組織的病理變化，采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分越高，表示骨關(guān)節(jié)炎程度越重。

1.3.3 免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)小鼠軟骨組織中HIF-2α 和MMP13 的表達(dá)情況 HIF-2α 和MMP13的陽(yáng)性表達(dá)為IHC 染色下呈現(xiàn)棕色。將切片脫蠟、水化，胰蛋白酶修復(fù)抗原、山羊血清封閉、滴加一抗（4 ℃）反應(yīng)12 h。所用一抗為Anti-HIF-2α:（1∶200），Anti-β-catenin:（1∶200），Anti-II 型膠原（1∶300）。采用Image J 1.8.0 軟件分析3 組小鼠軟骨層中相應(yīng)蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞所占軟骨面積的百分比。

1.3.4 免疫熒光（IF）檢測(cè)小鼠軟骨組織中β-catenin和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)情況 β-catenin 和Ⅱ型膠原陽(yáng)性表達(dá)為IF 下呈紅色。將切片脫蠟，水化，胰酶抗原修復(fù)，山羊血清封閉、滴加一抗（4 ℃）反應(yīng)12 h。隨后與山羊抗兔二抗（1∶300，37 ℃）反應(yīng)1 h。使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并及時(shí)拍照。使用Image Pro Plus 6.0 軟件選取小鼠軟骨區(qū)域，分別計(jì)量不同組別相應(yīng)蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度（IOD），使用GraphPad Prism 8.3.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同分組小鼠軟骨中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 表達(dá)變化 使用組織RNA 提取試劑盒提取小鼠關(guān)節(jié)軟骨中總RNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)。使用2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。所用qRT-PCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 所用qRT-PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，本研究數(shù)據(jù)滿足方差齊性要求，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠軟骨退變比較

番紅O 固綠和HE 染色結(jié)果顯示：相對(duì)于治療組，模型組小鼠的軟骨組織丟失較多，軟骨層變薄磨損較重；治療組小鼠可見(jiàn)部分軟骨丟失，軟骨組織較模型組厚，見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理改變（×400）

透明軟骨厚度：對(duì)照組>治療組>模型組，鈣化軟骨厚度和OARSI 評(píng)分：對(duì)照組<治療組<模型組（P 均＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠軟骨組織退變比較（±s）

表2 各組小鼠軟骨組織退變比較（±s）

OARSI評(píng)分/分對(duì)照組 84.96±3.92 19.13±1.54 0.44±0.35模型組 19.10±22.03* 85.03±3.01* 5.61±0.49*治療組 47.33±25.91*# 46.81±1.99*# 2.80±0.71*#F 值 98.32 106.79 188.32 P 值 <0.01 <0.01 <0.01組別 透明軟骨厚度/μm鈣化軟骨厚度/μm

2.2 各組小鼠軟骨組織中HIF-2α、MMP13、βcatenin 和Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)情況

IHC 結(jié)果顯示：模型組HIF-2α 和MMP13 表達(dá)量高于治療組和對(duì)照組，治療組高于對(duì)照組（P均＜0.01），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HIF-2α、MMP13 的表達(dá)情況（IHC×400）

表3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HIF-2α、MMP13 的陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

IF 結(jié)果顯示：模型組小鼠β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)高于治療組和對(duì)照組，治療組高于對(duì)照組（P 均＜0.01）；模型組小鼠軟骨組織中Ⅱ型膠原相對(duì)表達(dá)低于治療組和對(duì)照組，治療組低于對(duì)照組（P 均＜0.01），見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨β-catenin 和Ⅱ型膠原的表達(dá)情況（IF×400）

圖4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨β-catenin 和Ⅱ型膠原的IOD 值

2.3 各組小鼠HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 的表達(dá)情況

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，小鼠軟骨組織中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 表達(dá)量：對(duì)照組<治療組<模型組（P 均＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠軟骨組織中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 相對(duì)表達(dá)情況

3 討論

本研究結(jié)果可見(jiàn)，在OA 的發(fā)展過(guò)程中，軟骨細(xì)胞壞死丟失，表面被破壞，透明軟骨因磨損變薄而逐漸消失，模型組標(biāo)本可見(jiàn)鈣化軟骨厚度增加，OARSI 評(píng)分升高。IHC 結(jié)果顯示，軟骨破壞后，HIF-2α 蛋白的表達(dá)增加，提示其表達(dá)與OA的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。另外，通過(guò)造模和注射PT2399引發(fā)HIF-2α 表達(dá)變化時(shí)，HIF-2α 與β-catenin表達(dá)趨勢(shì)相同，qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，表明HIF-2α 可能對(duì)Wnt 通路具有調(diào)節(jié)作用。

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，對(duì)軟骨細(xì)胞起物理支持、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)Ⅱ型膠原的表達(dá)隨軟骨破壞的增加而逐漸減少。MMP13 是軟骨Ⅱ型膠原的主要降解酶，在OA 中發(fā)揮重要作用[15]。HIF-2α 和MMP13 的蛋白表達(dá)可隨軟骨破壞程度的增加而增加，提示在發(fā)生OA 時(shí)，HIF-2α 對(duì)MMP13存在誘導(dǎo)和協(xié)同作用[16-17]。

HIF-2α 定位于高分化軟骨細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)低氧環(huán)境下軟骨分解代謝的重要因子[18]。隨著小鼠和人的骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織內(nèi)HIF-2α 表達(dá)的含量增高，軟骨細(xì)胞的凋亡作用也呈增加的趨勢(shì)[7]。HIF-2α 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡是通過(guò)其對(duì)Fas基因來(lái)調(diào)控的。Fas 基因通過(guò)下游凋亡相關(guān)因子而引發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡，最終造成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的丟失與破壞[19]。另外，HIF-2α 能抑制軟骨細(xì)胞中的自噬，與軟骨破壞過(guò)程呈正相關(guān)[20]。

PT2399 可通過(guò)結(jié)合HIF-2α 的PASB 結(jié)構(gòu)域，改變其分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到干擾或抑制HIF-2α 的表達(dá)作用。在腎透明細(xì)胞癌中，pVHL 下調(diào)導(dǎo)致腎癌細(xì)胞惡性增殖，PT2399 在人腎透明細(xì)胞癌中分離了HIF-2α/HIF-1β 形成的異源性二聚體，這使得HIF-2α 的生物學(xué)作用被抑制，因此PT2399 對(duì)HIF-2α 產(chǎn)生了拮抗作用。

本研究將HIF-2α 抑制劑PT2399 應(yīng)用于小鼠OA 中，發(fā)現(xiàn)PT2399 具有延緩OA 發(fā)展的作用，這種用于治療腎癌的新型藥劑也許是治療OA及其相關(guān)研究的新方向。