枸杞多糖聯(lián)合人骨骼肌源性血管外膜細胞對人臍血CD34+細胞造血支持的體外研究

張 磊， 張思齊， 楊婷婷， 馬 潔， 鄭 波

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院人類干細胞研究所，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院血液內(nèi)科，銀川 750004）

枸杞（lycium barbarum）屬藥食同源植物，其主要成分枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）具有多種生物活性功能，在免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護、輻射防護、抗腫瘤、抗糖尿病、抗心血管疾病等方面發(fā)揮著一定作用[1-3]。近年來有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，LBP 可有效提高機體對白血病細胞的殺傷能力，促進白血病細胞凋亡，也能夠促進小鼠骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMNCs）的細胞增殖，減少放射損傷引起的骨髓細胞凋亡；LBP 還能保護骨髓基質(zhì)細胞及維持骨髓微環(huán)境穩(wěn)定，促進輻射損傷后造血功能恢復[6-8]。

骨髓基質(zhì)細胞對維持造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）正常造血功能起重要作用。目前常用的促進造血的間充質(zhì)干細胞主要來自成人骨髓，但年齡、侵襲性操作等因素限制了骨髓來源間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的應用[9]。CD146+血管外膜細胞（pericytes/perivascular cells，PCs）是普遍存在的間充質(zhì)干細胞的前體細胞，一直以來被認為是HSPCs 維持功能的關鍵支持者，是調(diào)節(jié)HSPCs 功能的骨髓生態(tài)位成分[10-11]。本課題組前期研究證實了CD146+人骨骼肌源性血管外膜細胞（human skeletal muscle-derived pericytes/perivascular cells，hMD-PCs）具有與人BMSCs 一樣的對人臍血（umbilical cord blood，UCB）CD34+HSPCs 體外支持的作用并且可以維持其分化潛能[12-13]，是支持HSPCs 體外擴增的一個嶄新而豐富的細胞來源。那么，LBP 聯(lián)合CD146+hMD-PCs能否進一步增強HSPCs 的擴增效力尚不明確，且國內(nèi)外目前相關研究報道較少。本研究通過建立細胞體外培養(yǎng)體系，探討LBP 聯(lián)合CD146+hMD-PCs 是否能夠增強人UCB CD34+HSPCs 的體外擴增效力。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

2020 年12 月至2021 年9 月收集研究標本。人骨骼肌標本來源于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手術中切除的骨骼肌組織，臍血標本來源于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)手術足月新生兒，患者及家屬均簽署知情同意書并獲得寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（編號：2020-099）。

LBP（北京索萊寶科技有限公司）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；胎牛血清（Biological Industries 公司）；FicollpaqueTMPLUS（GE 公司）；TrypLETMExpress、RPMI 1640 培養(yǎng)基、高糖型DMEM 培養(yǎng)基、PBS、青霉素/鏈霉素（Gibco 公司）；絲裂霉素、小鼠血清（Sigma 公司）；MethoCult H4535 Enriched without EPO（Stemcell 公司）；小鼠抗人抗體：CD45-APCH7、CD34-APC、CD33-FITC、CD10-PE、CD19-BV 421、CD14-Alexa Fluor 700，小鼠抗人同型對照抗體:APC-H7 IgG1、APC IgG1、FITC IgG1、PE IgG1、BV 421、Alexa Fluor 700 IgG2a、7-AADViaProbe（BD 公司）；人CD34 磁珠、MACSR BSA Stock Solution、auto MACSRinsing Solution、MACS 分選柱（Miltenyi Biotec 公司）；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板（Corning 公司）；離心管（Thermo 公司）；BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀（BD Biosciences 公司）；Perkin-Elmer VICTOR Nivo 酶標儀（PerkinElmer公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD146+hMD-PCs 的分選與UCB CD34+HSPCs 的分離純化 通過酶解與多參數(shù)流式細胞術分選獲得CD146+hMD-PCs（CD146+CD56-CD34-CD144-CD45-），具體參照課題組前期研究[12，14]。采集新鮮新生兒臍帶血并用Ficoll-paque分離液提取臍血單個核細胞，通過免疫磁珠分選UCB CD34+HSPCs。

1.2.2 CCK-8 法檢測LBP 對CD146+hMD-PCs增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的CD146+hMDPCs 用TrypLETMExpress 消化酶消化后以1.5×104/孔的濃度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后加入含不同濃度LBP（0、150、300、600、1 200 mg·L-1）的基礎培養(yǎng)基處理細胞24 h，每組設5 個復孔，之后除去上清，加入CCK-8 試劑-基礎培養(yǎng)基混合液（CCK-8 試劑與基礎培養(yǎng)基體積比為1∶9），培養(yǎng)箱孵育2 h 后，用酶標儀檢測各孔在450 nm 下的吸光度（A）值，并計算不同濃度LBP 處理后CD146+hMD-PCs 的活力值。

1.2.3 流式細胞術檢測LBP 對CD146+hMD-PCs細胞周期的影響 取對數(shù)生長期的CD146+hMDPCs 去除原培養(yǎng)基，加入LBP 濃度為150 mg·L-1的培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。消化并收集細胞，加入1 mL 預冷的PBS 清洗細胞2 次，離心后吸除上清，一邊渦旋一邊加入預冷的70%乙醇，以避免細胞成團，放置于4 ℃冰箱固定12 h。按試劑盒說明書配制碘化丙啶染色液，每管細胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min 后完成流式檢測。

1.2.4 建立UCB CD34+HSPCs 體外共培養(yǎng)體系 實驗分為4 組，LBP+CD146+hMD-PCs 組：將LBP 加入以CD146+hMD-PCs 為基質(zhì)細胞的UCB CD34+HSPCs 培養(yǎng)體系中；LBP 組：將LBP加入無基質(zhì)細胞的UCB CD34+HSPCs 培養(yǎng)體系中；CD146+hMD-PCs 組：作為對照組，不加LBP 只有基質(zhì)細胞CD146+hMD-PCs 與UCB CD34+HSPCs的共培養(yǎng)體系；空白對照組：無基質(zhì)細胞及LBP的UCB CD34+HSPCs 單獨培養(yǎng)體系。

各組基質(zhì)細胞以1.5×104/孔細胞密度接種于膠原包被的96 孔板中，每組設4 個復孔，CD146+hMD-PCs 組基質(zhì)細胞不做任何處理，LBP+CD146+hMD-PCs 組基質(zhì)細胞加入最佳濃度LBP，置于培養(yǎng)箱24 h，待基質(zhì)細胞貼壁后，用4 μg·mL-1濃度的絲裂霉素處理2 h，PBS 洗滌3 次，加入各自培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱24 h。將分離純化的UCB CD34+HSPCs 以5×104/孔的密度分別加至絲裂霉素處理后的基質(zhì)細胞層上，CD146+hMDPCs 組與空白對照組加入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基（RPMI 1640+5%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素），LBP+CD146+hMD-PCs 組和LBP 組加入LBP 濃度為150 mg·L-1共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.5 共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs 增殖情況分析 在共培養(yǎng)的1、2、4 周，收集各組懸浮UCB CD34+HSPCs，加入TrypLETMExpress 消化剩余細胞并用PBS 洗滌3 次收集，離心后重懸，使用臺盼藍染色后在倒置顯微鏡下計數(shù)活細胞。

1.2.6 共培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs 集落形成能力分析 在共培養(yǎng)第1、2、4 周時，分別收集各組UCB CD34+HSPCs，臺盼藍計數(shù)活細胞后，取3×103個細胞加入3 mL 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中并混勻，每1 mL 含UCB CD34+HSPCs 的培養(yǎng)基接種于35 mm×10 mm 的培養(yǎng)皿中，各培養(yǎng)體系設置3 皿，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 周后倒置顯微鏡下觀察集落形態(tài)并進行計數(shù)，顯微鏡下>50 個細胞的細胞團計為1 個集落。

1.2.7 共培養(yǎng)后流式細胞術檢測UCB CD34+HSPCs 的表型變化 在共培養(yǎng)的1、2、4 周時，收集各組UCB CD34+HSPCs，離心重懸后每毫升細胞懸液加入50 μL 小鼠血清，冰上封閉30 min。封閉后將各組細胞分為樣本管、同型管及空白管，樣本管每100 μL 細胞懸液分別加入CD45-APCH7、CD34-APC、CD33-FITC、CD10-PE、CD19-BV 421、CD14-Alexa Fluor 700 抗體各1 μL；同型管每100 μL 細胞懸液分別加入APC-H7、APC、FITC、PE、BV 421、Alexa Fluor 700 抗體各1 μL；空白管不加入任何抗體。樣本管及同型管加入抗體后冰上避光孵育30 min?？贵w孵育結(jié)束后離心清洗殘余抗體，并重懸至300 μL，每管加入7-AADViaProbe 5 μL，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。細胞周期、集落單位形成數(shù)量組間比較采用獨立樣本t 檢驗，LBP 濃度、細胞數(shù)量、造血標記表達等指標的多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP 對CD146+ hMD-PCs 增殖的影響

CCK-8 檢測結(jié)果（圖1）顯示，與未添加LBP組（0 mg·L-1）相比，LBP 濃度為150 mg·L-1時，CD146+hMD-PCs 活力升高（P＜0.01），LBP 濃度為600、1 200 mg·L-1時的CD146+hMD-PCs 活力均低于150 mg·L-1時（P 均＜0.05）。故選擇LBP濃度150 mg·L-1作為后續(xù)實驗的濃度。

圖1 不同濃度LBP 對CD146+hMD-PCs增殖的影響（n=5）

2.2 LBP 對CD146+ hMD-PCs 細胞周期的影響

細胞周期分析結(jié)果表明，未用LBP 處理的對照組（0 mg·L-1）G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞比例分別為（91.62±0.47）%、（6.04±0.24）%、（2.35±0.24）%，150 mg·L-1LBP 處理24 h 后的實驗組G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞比例分別為（71.15±0.43）%、（22.13±0.49）%、（6.52±0.30）%。兩組G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞比例差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01），見圖2。

圖2 LBP 對CD146+ hMD-PCs 細胞周期的影響（n=5）

2.3 共培養(yǎng)4 周后各培養(yǎng)體系的UCBCD34+HSPCs細胞數(shù)量變化

各培養(yǎng)體系接種UCB CD34+HSPCs 初始細胞數(shù)量約為5×104個。共培養(yǎng)1 周時，CD146+hMDPCs 組及LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)有所增長，而空白對照組及LBP 組細胞數(shù)量減少；空白對照組、CD146+hMD-PCs 組、LBP 組、LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)分別為（1.46±0.89）×104個/孔、（6.09±0.20）×104個/孔、（1.88±0.79）×104個/孔、（7.53±0.19）×104個/孔；與CD146+hMD-PCs組相比，LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)量增加，LBP 組細胞數(shù)量減少（P 均＜0.01）。

共培養(yǎng)至第2 周，CD146+hMD-PCs 組及LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)進一步增長，空白對照組及LBP 組細胞數(shù)量持續(xù)減少；空白對照組、CD146+hMD-PCs 組、LBP 組、LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)分別為（0.59±0.08）×104個/孔、（6.52±0.15）×104個/孔、（1.41±0.03）×104個/孔、（8.85±0.17）×104個/孔；LBP+CD146+hMD-PCs組細胞數(shù)量多于CD146+hMD-PCs 組（P＜0.01）；LBP 組細胞數(shù)量少于CD146+hMD-PCs 組，多于空白對照組（P 均＜0.01）。

共培養(yǎng)至第4 周時，CD146+hMD-PCs 組、LBP 組及LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)分別減少至（3.60±0.10）×104個/孔、（0.54±0.07）×104個/孔、（4.70±0.09）×104個/孔，空白對照組已無細胞存活；LBP+CD146+hMD-PCs 組細胞數(shù)量高于CD146+hMD-PCs 組，LBP 組細胞數(shù)量低于CD146+hMD-PCs 組（P 均＜0.01），見圖3。

圖3 共培養(yǎng)4 周后各培養(yǎng)體系的UCB CD34+ HSPCs 細胞數(shù)量變化（n=5）

2.4 共培養(yǎng)后各培養(yǎng)體系UCB CD34+ HSPCs 的集落形成能力

LBP+CD146+hMD-PCs 組共培養(yǎng)1、2、4 周后UCB CD34+HSPCs 的集落形成單位數(shù)分別為（130.00±4.26）、（68.75±3.25）、（38.75±4.54）個，CD146+hMD-PCs 組分別為（109.75±6.34）、（49.50±4.09）、（16.75±3.20）個，LBP+CD146+hMD-PCs組各時間點的集落形成單位數(shù)量均較CD146+hMDPCs 組升高（P 均＜0.05），見圖4?？瞻讓φ战M與LBP 組在共培養(yǎng)1、2、4 周時無集落形成。

圖4 各培養(yǎng)體系不同時間點UCB CD34+ HSPCs 集落形態(tài)及集落形成能力分析圖（n=5）

2.5 共培養(yǎng)后各培養(yǎng)體系的UCB CD34+HSPCs 的細胞表型變化

各培養(yǎng)體系共培養(yǎng)1、2、4 周后，UCB CD34+HSPCs 及其亞群比例均有不同程度變化。將全血細胞標記為CD45，造血祖細胞標記為CD34+CD33-，淋巴細胞標記為CD10、CD19，髓系細胞標記為CD14（圖5 A）。流式細胞術結(jié)果顯示，與CD146+hMD-PCs 組相比，LBP+CD146+hMD-PCs 組CD45+細胞比例在共培養(yǎng)1、2、4 周后均升高，CD34+CD33-細胞比例在共培養(yǎng)2 周后升高，CD10+CD19+、CD14+細胞比例在共培養(yǎng)2、4 周后升高（P均＜0.05）；與LBP 組相比，LBP+CD146+hMDPCs 組CD45+、CD34+CD33-、CD10+CD19+、CD14+細胞比例在共培養(yǎng)1、2、4 周后均升高（P 均＜0.05）；與CD146+hMD-PCs 組 相 比，LBP 組CD45+、CD34+CD33-、CD14+細胞比例在共培養(yǎng)1、2、4 周后均降低，CD10+CD19+細胞比例在共培養(yǎng)2、4 周后均降低（P 均＜0.05）。

此外，隨著培養(yǎng)時間延長，CD146+hMD-PCs組與LBP+CD146+hMD-PCs 組，兩組的CD45+細胞、CD34+CD33-細胞比例下降，而CD10+CD19+細胞、CD14+細胞比例上升，提示兩組的UCB CD34+HSPCs 均有向髓系及淋系分化的趨勢，而LBP 組CD45+、CD34+CD33-、CD10+CD19+及CD14+細胞比例下降，表明細胞逐漸死亡。由于空白對照組細胞數(shù)量少無法進行流式檢測，因此未對空白對照組進行細胞表型分析（圖5 B）。

圖5 共培養(yǎng)后各培養(yǎng)體系的UCB CD34+ HSPCs 的細胞表型變化分析圖（n=5）

3 討論

LBP 是一種天然植物多糖，來源廣泛且無毒副反應，在多種組織和細胞中具有抗氧化、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫功能[15-17]。研究[18]表明，LBP 可增強抗氧化酶清除自由基的活性、降低質(zhì)膜的流動性，減少自由基對細胞的損傷，促進氧化及輻射損傷中骨髓基質(zhì)細胞的增殖，保護造血系統(tǒng)。此外，LBP 不僅能對抗白血病細胞，抑制其增殖，而且還能緩解化療、放療引起的骨髓抑制，提高骨髓淋巴細胞活性，解除放化療后骨髓抑制引起的免疫力低下，并促進HSPCs 及外周血細胞的恢復[8，19-20]。

HSPCs 具自我更新能力和多系分化潛能，可以在進行骨髓移植后的受體中重建造血系統(tǒng)[21-22]，但HSPCs 的增殖和分化依賴于骨髓微環(huán)境成分產(chǎn)生的調(diào)控因子[23]。CD146+PCs 已被證明是BMSCs 的前體細胞，為調(diào)節(jié)HSPCs 功能的骨髓微環(huán)境成分[24-26]，通過細胞間接觸或旁分泌效應，由在CD146+PCs 表面表達的跨膜Notch 配體Jagged-1 介導，與HSPCs 表達的受體Notch1 相互作用維持HSPCs 增殖，是HSPCs 維持的關鍵支持者[27-29]。課題組前期研究[12]證實，CD146+hMDPCs 表達經(jīng)典的BMSCs 標志CD44、CD73、CD90、CD105。在體外適當?shù)恼T導條件下，CD146+hMDPCs 可分化為骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞，并進一步證明CD146+hMD-PCs 與BMSCs 一樣對UCB CD34+HSPCs 具有體外支持作用。

本研究結(jié)果顯示，相同條件下，在有基質(zhì)細胞CD146+hMD-PCs 的培養(yǎng)體系中加入LBP，HSPCs 的細胞數(shù)量較CD146+hMD-PCs 組升高，說明在LBP 的促進下，基質(zhì)細胞CD146+hMD-PCs維持HSPCs 體外擴增的作用增強。無基質(zhì)細胞的LBP 與UCB CD34+HSPCs 培養(yǎng)體系細胞的數(shù)量與CD146+hMD-PCs 組相比減少，與空白對照組相比，細胞數(shù)量增多，這可能與LBP 的抗氧化損傷功能有關。集落形成能力反映培養(yǎng)后UCB CD34+HSPCs產(chǎn)生造血祖細胞的功能，LBP+CD146+hMD-PCs培養(yǎng)體系的集落形成單位數(shù)量多于以CD146+hMD-PCs 為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系，而無基質(zhì)細胞存在的LBP 組其UCB CD34+HSPCs 在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 周后無集落形成，表明在有CD146+hMD-PCs 基質(zhì)細胞與UCB CD34+HSPCs共培養(yǎng)體系中加入LBP 可增強HSPCs 保持自我更新的能力。

流式細胞檢測結(jié)果顯示，在LBP 的作用下，CD146+hMD-PCs 促 進UCB CD34+HSPCs 向CD14+細胞、CD10+CD19+細胞分化，且分化能力強于未添加LBP 的CD146+hMD-PCs 組，而LBP 組CD45+細胞、CD34+CD33-細胞、CD14+細胞、CD10+CD19+細胞比例逐漸下降，且無分化趨勢，證實了在LBP 與CD146+hMD-PCs 聯(lián)合作用下，UCB CD34+HSPCs 能夠保持更好的多向分化的能力。本研究顯示，在無基質(zhì)細胞情況下LBP 單獨作用于UCB CD34+HSPCs 無法促進其細胞增殖、分化，培養(yǎng)后也無集落形成，說明HSPCs 增殖依賴骨髓微環(huán)境，僅有LBP 而無基質(zhì)細胞無法維持HSPCs增殖；但LBP 可以通過促進基質(zhì)細胞CD146+hMDPCs 增殖從而促進UCB CD34+HSPCs 細胞的體外增殖、分化。

綜上所述，LBP 作為一個促進造血功能恢復的天然化合物，具有潛在的臨床應用價值。未來應進一步深入研究LBP 在體內(nèi)的生物學功能，以期為促進造血干細胞的增殖提供更加廣泛的藥物來源與新的治療途徑。