丹參酮膠囊對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用

徐霞 周欣 梁景耀 彭麗倩 李仰琪 林春生 萬長蘭 李振潔 李潤祥 葉興東

廣州市皮膚病防治所皮膚科，廣州 510095

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。目前治療尋常型銀屑病的傳統(tǒng)藥物主要有環(huán)孢素、甲氨蝶呤、阿維A等，但傳統(tǒng)藥物的不良反應(yīng)較多。雖然一些針對銀屑病發(fā)病機制中關(guān)鍵炎癥因子的生物制劑［如腫瘤壞死因子（TNF）-α抑制劑和白細胞介素（IL）-17A拮抗劑］已應(yīng)用于臨床，并取得了良好的效果，但這些生物制劑價格昂貴，而且銀屑病合并炎癥性腸病、結(jié)核、肝炎的患者禁用［1］。因此，探索新的有效、不良反應(yīng)少且經(jīng)濟的治療藥物仍然是銀屑病領(lǐng)域研究的重點和熱點。

免疫學(xué)異常是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，TNF-α–IL-23–Th17炎性反應(yīng)通路在T細胞介導(dǎo)的斑塊型銀屑病中起著重要作用［2］。此外，越來越多的研究表明機體氧化應(yīng)激水平的增高在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［3］。銀屑病皮損中存在核因子E2相關(guān)因子-2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）水平下調(diào)，其下游的人血紅素加氧酶1（heme oxygense-1，HO-1）水平下降［4］。在銀屑病皮損處，角質(zhì)形成細胞和浸潤的炎癥細胞產(chǎn)生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［5］，ROS可作為第二信使參與調(diào)控、活化細胞膜等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞發(fā)生增殖和分化［6］。丹參酮（亦稱總丹參酮）是唇形科植物丹參根部的提取物，屬于二萜醌類化合物，包括隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮-Ⅰ、丹參酮Ⅱ-A等有效成分，國內(nèi)外研究表明其具有較強的抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮通過降低衰老模型小鼠皮膚中脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，從而發(fā)揮抗氧化作用［8］。但在銀屑病中，丹參酮膠囊是否通過抗炎和抗氧化應(yīng)激發(fā)揮作用目前尚未清楚。因此本研究擬通過構(gòu)建咪喹莫特（imiquimod，IMQ）誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型，探討丹參酮膠囊對銀屑病的治療作用及其對銀屑病發(fā)病機制中關(guān)鍵炎癥因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，揭示其治療作用機制，為其用于銀屑病治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1、試劑與儀器

（1）試劑：IMQ乳膏（美國Sigma公司），酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）稀釋液（美國eBioscience，San Diego，CA），血清TNF-α和IL-17A的ELISA檢測試劑盒（美國eBioscience公司），丹參酮膠囊（河北興隆希力藥業(yè)有限公司），抗體Nrf2［ab76026，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，抗體HO-1［ab52947，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，抗體SOD2［ab68155，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，免疫組化試劑盒［RE7280-CN，澳泉（AQ），中山市澳泉醫(yī)療科技有限公司］，Evo M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AG11705，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd），SYBR Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit（AG11701，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd）。（2）儀器：酶標(biāo)儀（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies Inc，美國），光學(xué)顯微鏡（Olympus D72，Olympus Corporation，日本），LC480熒光PCR儀（LC480，Roche，美國），全自動脫水機（Leica TP1020，Leica，德國），包埋機（Arcadia，Leica，德國），切片機（Leica RM2125RTS，Leica，德國），全自動H&E（蘇木精-伊紅）染色機（Leica EM AC20，Leica，德國）。

2、動物飼養(yǎng)與分組給藥

Balb/C小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心［許可證號：SCXK（粵）2018-0002］，雄性，體質(zhì)量18～22 g，用標(biāo)準飲食和水喂養(yǎng)。實驗采用8周齡的小鼠，隨機分成3組：正常組、模型組和丹參酮膠囊組，每組3只。所有的體內(nèi)實驗根據(jù)實驗動物研究委員會指南和機構(gòu)動物保護和使用委員會的規(guī)定批準的。剃除小鼠背毛露出2 cm×3 cm的皮膚區(qū)域，正常組小鼠每天背部涂抹凡士林，模型組和丹參酮膠囊組小鼠背部涂抹IMQ乳膏60 mg/d，共14 d。與此同時正常組和模型組給予腹腔注射生理鹽水，丹參酮膠囊組通過灌胃方式給予丹參酮膠囊內(nèi)容物［1 500 mg/（kg·d）］，分3次灌服，每天1次，連續(xù)8 d。于第8天，背部皮膚拍照后摘除眼球取血，脫頸處死，取皮損組織。血液室溫靜置30 min，2 000×g離心10 min，分裝后保存于-80℃冰箱中。

3、小鼠背部皮膚銀屑病表型的監(jiān)測及評分

借鑒臨床上使用的銀屑病PASI評分標(biāo)準，對小鼠背部皮膚的炎性反應(yīng)程度進行評估。實驗期間由同一人進行評估，評估內(nèi)容包括紅斑、鱗屑和増厚。評估內(nèi)容的評分標(biāo)準如下：0＂無現(xiàn)象＂；1＂輕微＂；2＂中度＂；3＂顯著＂，4＂十分顯著＂?？偡值牡梅譃榧t斑、鱗屑以及增厚各項評分之和，以總分評估炎癥嚴重反應(yīng)程度。

4、組織學(xué)分析

將受試區(qū)皮膚置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，進行脫水、石蠟包埋、切片，然后對石蠟切片進行HE染色。使用光學(xué)顯微鏡檢查觀察皮膚組織病理學(xué)變化。

5、ELISA

血液經(jīng)離心機2 000×g離心10 min，產(chǎn)生血清樣本。血清樣本用ELISA稀釋液（eBioscience，San Diego，CA，USA）稀釋10倍。根據(jù)ELISA試劑盒說明書（eBioscience），測定血清TNF-α和IL-17A濃度。使用BMG酶標(biāo)儀測量450 nm和540 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準曲線計算濃度。

6、數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)為計量資料，符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。試驗結(jié)果采用SPSS軟件18.0（芝加哥，美國）軟件統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析各組間的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、丹參酮膠囊改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的形態(tài)學(xué)特征

與正常對照小鼠相比，IMQ外擦5 d后小鼠背部出現(xiàn)銀屑病樣病變癥狀，如出現(xiàn)紅斑、鱗屑增多以及皮膚增厚（圖1）。與IMQ組相比，丹參酮膠囊處理組小鼠背部皮損紅斑減輕、鱗屑減少、皮膚厚度變薄，并且銀屑病PASI評分下降（P<0.05）（圖2）。HE染色顯示IMQ誘導(dǎo)組小鼠背部皮膚出現(xiàn)表皮增生，棘層增厚，丹參酮膠囊處理組表皮層厚度顯著降低（圖3）。以上結(jié)果提示丹參酮膠囊可以改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠的皮損，降低表皮厚度，說明其對銀屑病樣皮損有治療效果。

圖1 各組小鼠皮膚外觀

圖2 丹參酮膠囊顯著減輕銀屑病樣小鼠的紅斑（A）、鱗屑（B）、皮膚厚度（C）以及PASI評分（D）

圖3 A為HE染色觀察小鼠皮膚病理變化（原始放大倍數(shù)，頂部40×，底部200×）；B為顯微鏡下測定表皮厚度

2、丹參酮膠囊降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平

IL-17A和TNF-α是銀屑病發(fā)病過程中的關(guān)鍵細胞因子，為了探討丹參酮膠囊對這兩個關(guān)鍵細胞因子表達是否有影響，我們檢測了小鼠血清中IL-17A和TNF-α的水平。與正常對照組相比，IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平升高，而丹參酮膠囊處理后可以降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平（圖4）。

圖4 丹參酮膠囊降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A（A）和TNF-α（B）的水平

3、丹參酮膠囊在銀屑病樣小鼠中的抗氧化作用

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，IMQ誘導(dǎo)后，組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NAD（P）H醌氧還原酶-1［NAD（P）H quinoneoxid oreductase 1，NQO1］的mRNA水平顯著降低，丹參酮膠囊處理后，銀屑病樣小鼠組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平明顯升高（圖5）。免疫組化染色也顯示丹參酮膠囊增加了IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠皮膚組織中Nrf2、HO-1和SOD2的表達（圖6）。以上結(jié)果提示丹參酮膠囊在銀屑病樣小鼠中具有抗氧化作用。

圖5 丹參酮膠囊誘導(dǎo)Nrf2（B）及下游基因HO-1（A）、SOD2（C）和NQO1（D）的mRNA轉(zhuǎn)錄

圖6 丹參酮膠囊誘導(dǎo)Nrf2（B）及下游蛋白HO-1（A）和SOD2（C）的表達

討 論

銀屑病是一種常見的慢性、復(fù)發(fā)性的炎癥性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜。角質(zhì)形成細胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤是銀屑病的3個最主要的病理特點［9］。最近的研究表明，一些突變可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異?；钴S系統(tǒng)，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)增強以及隨之而來的氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。

既往研究顯示，Th1細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、Th17細胞活化及IL-23/IL-17軸參與了IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損的形成［11］。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型中也存在異常的氧化-抗氧化系統(tǒng)，例如髓過氧化物酶水平升高，SOD活性降低［12］。因此，我們選擇這一模型用于研究丹參酮膠囊的抗炎和抗氧化作用。IMQ外擦5 d后，小鼠背部出現(xiàn)銀屑病樣病變癥狀，包括紅斑、鱗屑、皮膚增厚。組織病理學(xué)檢查也證實小鼠背部皮膚表皮棘細胞層明顯增厚。我們用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠血清中TNF-α和IL-17A水平較正常對照組升高，這與銀屑病患者血清中TNF-α和IL-17A的水平升高相一致［13-14］。此外本研究也發(fā)現(xiàn)銀屑病樣小鼠組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平顯著降低，揭示銀屑病樣模型小鼠中存在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱。氧化應(yīng)激可通過多種信號通路促進炎性反應(yīng)，包括NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3（STAT3）轉(zhuǎn)錄［2，4］。因此，我們推測銀屑病樣小鼠體內(nèi)可能由于抗氧化應(yīng)激能力減弱，導(dǎo)致過量的ROS不能被清除，增強了MAPK/AP-1、NF-κB和JAK-STAT等信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得炎癥因子及趨化因子表達增多，從而對角質(zhì)形成細胞的增殖與分化產(chǎn)生影響。

丹參酮膠囊處理后銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平下降。本研究提示丹參酮膠囊可以降低銀屑病發(fā)病過程中的關(guān)鍵細胞因子IL-17A和TNF-α的水平，從而對銀屑病的炎癥水平造成影響。TNF-α是一種在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子，它可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，通過多種方式直接或間接地誘導(dǎo)銀屑病的病理發(fā)生。使用TNF-α受體拮抗劑依那西普可以降低斑塊型銀屑病患 者 體 內(nèi)IL-1、IL-8、干 擾 素（IFN）-γ誘導(dǎo)蛋白（CXCL10）和巨噬細胞炎性蛋白-3a（CCL20）mRNA的表達，從而分別引起中性粒細胞、T淋巴細胞和樹突狀細胞浸潤減少［15］。IL-17A被認為是建立和維持銀屑病表型的關(guān)鍵細胞因子。IL-17A通過結(jié)合角質(zhì)形成細胞、樹突狀細胞、皮膚纖維母細胞和內(nèi)皮細胞上的IL-17A受體而發(fā)揮作用［16］。IL-17A可以激活皮膚角質(zhì)形成細胞促進其增殖，亦可促進角質(zhì)形成細胞釋放趨化因子從而導(dǎo)致中性粒細胞和可產(chǎn)生IL-17A的CCR6+免疫細胞的募集［17］。此外，IL-17還可與TNF-α等炎癥因子協(xié)同，放大加強其致炎效應(yīng)［18］。

機體氧化與抗氧化的平衡有多種機制參與，其中Nrf2是啟動抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2激活劑可上調(diào)其下游的抗氧化酶基因如HO-1、SOD、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等和Ⅱ相解毒酶如NQO1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸羧基轉(zhuǎn)移酶等靶基因。國外Ⅲ期臨床試驗顯示二甲基延胡索酸對中、重度銀屑病患者有較強療效［19］。二甲基延胡索酸對銀屑病的治療作用與其可通過激活Nrf2，上調(diào)谷胱甘肽、誘導(dǎo)抗氧化基因的表達，進而減少ROS的產(chǎn)生相關(guān)［5］。因此，糾正銀屑病患者體內(nèi)異常的氧化應(yīng)激，是銀屑病治療的潛在靶點。Tao等［20］對紫外線光損傷的研究，發(fā)現(xiàn)總丹參酮中的丹參酮-Ⅰ、二氫丹參酮、丹參酮Ⅱ-A和隱丹參酮可以通過激活Nrf2，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞內(nèi)NQO1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表達，增加細胞內(nèi)谷胱甘肽的水平。因此，我們推測丹參酮膠囊可能可以通過激活Nrf2在銀屑病模型中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。我們的研究結(jié)果也顯示丹參酮膠囊可以增加銀屑病樣小鼠皮膚組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平，免疫組化也證實HO-1、SOD2和Nrf2的蛋白水平表達增加。以上研究提示丹參酮膠囊可以通過激活Nrf2及其下游抗氧化基因從而在銀屑病樣小鼠模型中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，丹參酮膠囊對小鼠銀屑病樣病變癥狀的改善作用，與其可降低血清中IL-17A和TNF-α的水平及激活Nrf2通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。由于丹參酮膠囊是復(fù)合成分，后續(xù)可進一步對其中的單體進行研究，篩選出對銀屑病模型治療具有最佳效果的單體及其合適的劑量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突