miR-181a調(diào)控PINK1/Parkin通路對骨質(zhì)疏松大鼠破骨細胞線粒體自噬的影響

祝震亞，童蕾，陸燕群

嘉興市中醫(yī)醫(yī)院骨科，浙江嘉興 314001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨代謝異常性疾病[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞吸收亢進是引起OP骨量減少及骨結(jié)構(gòu)破壞的重要原因[2]。破骨細胞在骨吸收過程中發(fā)揮著重要作用[3]。線粒體自噬有助于及時清除細胞內(nèi)堆積的受損線粒體，從而維持細胞的存活[4-5]，但有關(guān)線粒體自噬對OP骨代謝影響的研究較少。PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTENinduced kinase 1，PINK1)可聚集于線粒體外膜，促進帕金森病相關(guān)基因(Parkinson-related genes，Parkin)蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體表面，引起線粒體蛋白泛素化修飾，從而誘導(dǎo)線粒體自噬[6]。但PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬在破骨細胞存活及骨吸收過程中的調(diào)節(jié)作用鮮見報道。

短鏈非編碼微小RNA分子(microRNA，miRNA)參與了OP等骨代謝疾病的骨骼重塑[7-8]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在OP模型小鼠中呈高表達[9]，可靶向調(diào)控骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的水平，影響破骨細胞活性[10]；miRNA基因靶點預(yù)測結(jié)果顯示，miR-181a與Parkin之間存在靶向負調(diào)控作用，提示miR-181a可能靶向調(diào)控PINK1/Parkin自噬通路，影響破骨細胞活性，從而參與OP的發(fā)生發(fā)展。本研究探討了miR-181a調(diào)控PINK1/Parkin通路對OP大鼠破骨細胞線粒體自噬的影響，以期闡明OP破骨細胞骨吸收靶向調(diào)控的機制，為OP的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 MTT試劑盒(EY-19238)購自上海一研生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(TR205-50)購自北京天漠科技開發(fā)公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CD-G102537m)購自武漢純度生物科技有限公司；兔抗PINK1(abs137219)購自上海愛必信生物科技有限公司；兔抗Parkin(ab15494)、小鼠抗線粒體外膜標(biāo)記蛋白(TOMM20；ab56783)、兔抗線粒體自噬受體蛋白(NIX；ab109414)、兔抗溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2；ab120568)、兔抗泛素蛋白(ubiquitin，Ub；ab140601)、兔抗自噬選擇性底物(p62；ab109012)購自美國Abcam公司；兔抗凋亡剪切蛋白-半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3；AF7022)、兔抗微管輕鏈蛋白3-Ⅱ/Ⅰ(LC3-Ⅱ/Ⅰ；AF5402)購自常州Affinity公司。JCM-6000電子顯微鏡購自日本尼康公司；Talos F200S G2S/TEM透射電鏡購自美國賽默飛公司；ImageXpress激光共聚焦顯微鏡購自上海美谷分子儀器有限公司；CytoFLEX SRT流式細胞儀購自中國貝克曼庫爾特商貿(mào)公司。

1.2 實驗動物及分組 健康雌性SD大鼠20只，6～8周齡，體重200～220 g，購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2020-0055]，于嘉興市中醫(yī)醫(yī)院動物房中常規(guī)飼養(yǎng)。隨機分為OP模型組(n=10)與對照組(n=10)，OP模型組參照文獻[11]的方法摘除雙側(cè)卵巢，對照組大鼠只暴露卵巢不行摘除術(shù)。2個月后，采用micro-CT掃描大鼠右后肢股骨，若骨結(jié)構(gòu)參數(shù)如骨密度、骨體積分數(shù)降低，則表示造模成功(10只全部造模成功)。本研究符合3R原則，實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.3 大鼠破骨細胞提取 處死大鼠，參照文獻[12]的方法在無菌條件下分離提取大鼠四肢長骨中的破骨細胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)及噬骨實驗鑒定后，按照1×108個/L、100 μl/孔的密度接種于6孔板中。

1.4 破骨細胞轉(zhuǎn)染si-miR-181a實驗分組 OP大鼠破骨細胞分為OP組(未轉(zhuǎn)染，正常培養(yǎng))、si-miR-181a組(轉(zhuǎn)染si-miR-181a)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC陰性對照質(zhì)粒)、ad-miR-181a組(轉(zhuǎn)染ad-miR-181a)與ad-NC組(轉(zhuǎn)染ad-NC陰性對照質(zhì)粒)；對照組大鼠破骨細胞正常培養(yǎng)，設(shè)為正常對照組。各組分別設(shè)置6個復(fù)孔，實驗重復(fù)6次。構(gòu)建miR-181a低表達(si-miR-181a)、高表達(ad-miR-181a)載體及陰性對照(si-NC、ad-NC)質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別用各載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組破骨細胞，繼續(xù)在M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)試驗。

1.4.1 RT-PCR檢測破骨細胞中miR-181a的表達收集各組細胞，粉碎裂解、研磨后，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性110 s；95 ℃ 55 s，50～60 ℃ 60 s，72 ℃ 50 s，共45個循環(huán)；75 ℃延伸60 s。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-181a表達水平。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計合成，miR-181a引物序列：正義鏈5'-CTTTGGTTAT AATTCCTAAGTGGCACC-3'，反義鏈5'-ATTGGC AACCCTCGTTCCCTTTACCA-3'；U6引物序列：正義鏈5'-TCCTCCGATCGTGTCACG-3'，反義鏈5'-ACGTGACAAGTTCGGAGA-3'。

1.4.2 MTT法及流式細胞術(shù)檢測破骨細胞存活及凋亡情況 取各組細胞，加入20 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于490 nm波長處檢測吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%。取各組細胞，調(diào)整濃度重懸后，加入Annexin V-FTTC及PI孵育30 min，采用流式細胞儀檢測破骨細胞凋亡情況。

1.4.3 透射電鏡觀察破骨細胞中線粒體結(jié)構(gòu)及自噬情況 收集各組細胞，用胰酶消化后，加入2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，脫水、浸透處理后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染并于透射電鏡下觀察。

1.4.4 免疫熒光共定位檢測破骨細胞線粒體中Parkin的表達情況 收集各組細胞，用4%多聚甲醛溶液固定及0.5%曲拉透明化處理，加入兔抗Parkin(1∶500)及小鼠抗TOMM20(1∶500)抗體4 ℃孵育24 h；洗滌后，加入TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200)及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶200)二抗37 ℃孵育40 min，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)Parkin與TOMM20陽性共表達區(qū)域的平均光密度值(MD)。

1.4.5 Western blotting檢測目的蛋白表達 收集各組細胞，裂解、勻漿，提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入PINK1、Parkin、NIX、LC3、LAMP2、Ub、p62、cleaved caspase-3一抗(1∶1000)及β-actin內(nèi)參抗體(1∶1500)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育1.5 h。采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageJ軟件分析上述目的蛋白條帶的灰度值。

1.5 破骨細胞共轉(zhuǎn)染si-miR-181a和si-Parkin取OP大鼠破骨細胞，按照1×108個/L、100 μl/孔的密度接種于6孔板中，設(shè)置空白對照組(正常培養(yǎng))、simiR-181a+si-Parkin組(轉(zhuǎn)染si-miR-181a和si-Parkin)、si-miR-181a組(轉(zhuǎn)染si-miR-181a和si-NC-2陰性對照質(zhì)粒)、si-Parkin組(轉(zhuǎn)染si-Parkin和si-NC陰性對照質(zhì)粒)與空載質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染si-NC、si-NC-2陰性對照質(zhì)粒)。構(gòu)建Parkin低表達(si-Parkin)載體質(zhì)粒及陰性對照(si-NC-2)質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至各組破骨細胞。轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)48 h后，采用RT-qPCR檢測miR-181a的表達(詳細步驟見1.4.1)，MTT法測定細胞存活率(詳細步驟見1.4.2)，Western blotting檢測PINK1蛋白的表達(詳細步驟見1.4.5)。

1.6 線粒體/溶酶體共定位檢測 細胞分組及處理方法同1.5，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，加入終濃度為10 μmol/L的氧化磷酸化解耦聯(lián)劑(FCCP)處理6 h，PBS洗滌后，加入線粒體膜綠色熒光標(biāo)記染料(Mito Tracker Green，MTR green，200 nmol/L)，37 ℃下染色30 min；加入溶酶體紅色熒光標(biāo)記染料(Lyso Tracker Red，LTR red，25 nmol/L)染色10 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7miR-181a與Parkin的靶向關(guān)系預(yù)測 采用miRtarbase軟件預(yù)測miR-181a與ParkinmRNA的結(jié)合位點。

1.8 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-181a與Parkin的靶向關(guān)系 構(gòu)建有miR-181a結(jié)合序列的Parkin-3'UTR野生型(WT)和Parkin-3'UTR突變型(MUT)片段，克隆至螢火蟲熒光素酶載體質(zhì)粒(pmiR-Report)載體中，分別與miR-181a模擬物(miR-181a-mimics)及其陰性對照(miR-181a-NC)共轉(zhuǎn)染至破骨細胞中，設(shè)置miR-181a-mimics+WT組(轉(zhuǎn)染miR-181amimics及Parkin-3'UTR-WT)、WT組(轉(zhuǎn)染miR-181a-NC及Parkin-3'UTR-WT)、miR-181a-mimics+MUT組(轉(zhuǎn)染miR-181a-mimics及Parkin-3'UTR-MUT)與MUT組(轉(zhuǎn)染miR-181a-NC及Parkin-3'UTR-MUT)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測螢火蟲熒光活性/海腎熒光活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8及SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OP大鼠骨密度及骨體積分數(shù)檢測結(jié)果 與對照組比較，OP模型組大鼠骨密度[(273.59±12.16) mg/cm3vs. (420.01±20.10) mg/cm3，P＜0.05]及骨體積分數(shù)(5.59%±0.56%vs. 22.32%±2.12%，P＜0.05)均明顯降低，表明OP模型造模成功。

2.2 上調(diào)或下調(diào)miR-181a的表達對大鼠破骨細胞存活及凋亡的影響 與正常對照組比較，OP組破骨細胞中miR-181a表達水平升高(1.59±0.15vs.1.02±0.11，P＜0.05)。與OP組比較，ad-miR-181a組破骨細胞中miR-181a表達水平升高(2.02±0.20，P＜0.05)，si-miR-181a組破骨細胞中miR-181a表達水平降低(0.93±0.09，P＜0.05)。ad-NC組、si-NC組與OP組破骨細胞中miR-181a表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.52±0.12vs. 1.56±0.15vs. 1.59±0.15，P＞0.05)。

與正常對照組比較，O P 組破骨細胞存活率、凋亡率升高(P＜0.05)。與OP組比較，ad-miR-181a組破骨細胞存活率升高(P＜0.05)，凋亡率降低(P＜0.05)，si-miR-181a組破骨細胞存活率降低(P＜0.05)，凋亡率升高(P＜0.05)。ad-NC組、si-NC組破骨細胞存活率、凋亡率與OP組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05) (圖1，表1)。

表1 各組大鼠破骨細胞存活率、凋亡率比較(±s, n=6)Tab.1 Comparison of osteoclast's survival rate and apoptosis rate in each group of rats (±s, n=6)

表1 各組大鼠破骨細胞存活率、凋亡率比較(±s, n=6)Tab.1 Comparison of osteoclast's survival rate and apoptosis rate in each group of rats (±s, n=6)

與正常對照組比較，(1)P＜0.05；與OP組比較，(2)P＜0.05

組別 細胞存活率(%) 細胞凋亡率(%)正常對照組 100.09±0.05 1.05±0.11 OP組 157.06±12.32(1) 10.23±1.09(1)ad-miR-181a組 222.96±22.15(2) 3.28±0.35(2)si-miR-181a組 106.96±10.15(2) 19.71±1.83(2)ad-NC組 159.65±13.28 10.33±0.95 si-NC組 150.22±12.06 10.26±1.08

圖1 各組大鼠破骨細胞凋亡情況Fig.1 Osteoclast apoptosis in each group of rats A. 正常對照組；B. OP組；C. ad-miR-181a組；D. si-miR-181a組；E. ad-NC組；F. si-NC組

2.3 上調(diào)或下調(diào)miR-181a的表達對大鼠破骨細胞自噬的影響 透射電鏡觀察顯示，正常對照組破骨細胞線粒體輪廓清晰，崤完整，僅有少量自噬體形成。OP組破骨細胞可見線粒體嵴斷裂、空泡樣變化、自噬體形成增多。與OP組比較，ad-miR-181a組破骨細胞中線粒體腫脹、嵴斷裂及空泡樣變化緩解，自噬體形成減少；si-miR-181a組線粒體腫脹、嵴斷裂及空泡樣變化加重，自噬體形成增多。ad-NC組、si-NC組破骨細胞自噬形態(tài)與OP組相近(圖2)。免疫熒光共定位檢測結(jié)果顯示，正常對照組破骨細胞中僅少量Parkin表達于線粒體外膜(TOMM20陽性標(biāo)記部位)上，OP組破骨細胞中大量Parkin表達于線粒體外膜上。與正常對照組比較，OP組破骨細胞中Parkin+TOMM20+、PINK1、Parkin蛋白表達水平升高(P＜0.05)。與OP組比較，admiR-181a組破骨細胞Parkin+TOMM20+、PINK1、Parkin蛋白表達水平降低，si-miR-181a組破骨細胞Parkin+TOMM20+、PINK1、Parkin蛋白表達水平升高(P＜0.05)。ad-NC組、si-NC組Parkin+TOMM20+、PINK1、Parkin蛋白表達水平與OP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖3-4，表2)。

圖2 各組破骨細胞電鏡觀察圖Fig.2 Electron microscope observation of osteoclasts in each groupA. 正常對照組；B. OP組；C. ad-miR-181a組；D. si-miR-181a組；E. ad-NC組；F. si-NC組

圖3 各組Parkin與TOMM20免疫熒光染色共定位圖(×400)Fig.3 Co-localization map of Parkin and TOMM20 in each group (Immunofluorescence staining, ×400)

圖4 各組破骨細胞中PINK1/Parkin通路蛋白表達情況(Western blotting)Fig.4 Expression of PINK1/Parkin pathway protein in osteoclasts of each group (Western blotting)

表2 各組破骨細胞中PINK1/Parkin通路蛋白表達水平比較(±s, n=6)Tab.2 Comparison of the expression levels of PINK1/Parkin pathway proteins in osteoclasts of each group (±s, n=6)

表2 各組破骨細胞中PINK1/Parkin通路蛋白表達水平比較(±s, n=6)Tab.2 Comparison of the expression levels of PINK1/Parkin pathway proteins in osteoclasts of each group (±s, n=6)

Parkin. 帕金森病相關(guān)基因；TOMM20. 小線粒體外膜標(biāo)記蛋白；與正常對照組比較，(1)P＜0.05；與OP組比較，(2)P＜0.05

組別 Parkin+TOMM2+(MD/mm2) PINK1 Parkin正常對照組 0.13±0.10 1.03±0.10 1.13±0.10 OP組 2.02±0.20(1) 1.93±0.19(1) 1.83±0.18(1)ad-miR-181a組 1.01±0.11(2) 1.21±0.12(2) 1.10±0.11(2)si-miR-181a組 2.97±0.29(2) 2.73±0.29(2) 2.73±0.27(2)ad-NC組 2.09±0.19 1.99±0.19 1.89±0.18 si-NC組 2.04±0.20 1.94±0.18 1.84±0.17

2.4 上調(diào)或下調(diào)miR-181a表達對大鼠破骨細胞中PINK1/Parkin通路下游蛋白表達的影響 與正常對照組比較，OP組破骨細胞中NIX、LAMP2、Ub、p62蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P＜0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達水平降低(P＜0.05)。與OP組比較，ad-miR-181a組破骨細胞中NIX、LAMP2、Ub、p62、cleaved caspase-3蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05)，si-miR-181a組破骨細胞中NIX、LAMP2、Ub、p62及cleaved caspase-3蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P＜0.05) (圖5)。

圖5 各組破骨細胞中NIX、LAMP2、Ub、p62、cleaved caspase-3蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較(±s, n=6)Fig.5 Comparison of the expression levels of NIX, LAMP2, Ub, p62, cleaved caspase-3 protein and ratio of LC3-Ⅱ/Ⅰ in each group of osteoclasts (±s, n=6)

2.5 共轉(zhuǎn)染si-miR-181a和si-Parkin對破骨細胞存活率、miR-181a及Parkin蛋白表達的影響 與空白對照組比較，si-miR-181a組細胞存活率、miR-181a表達水平降低(P＜0.05)，Parkin蛋白表達水平升高(P＜0.05)，si-Parkin組細胞存活率升高(P＜0.05)，Parkin蛋白表達水平降低(P＜0.05)，miR-181a表達水平無明顯變化(P＞0.05)。與si-miR-181a組比較，si-miR-181a+si-Parkin組Parkin蛋白表達水平降低(P＜0.05)，細胞存活率升高(P＜0.05)，miR-181a表達水平無明顯變化(P＞0.05)。空載質(zhì)粒對照組上述指標(biāo)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖6、表3)。

圖6 各組破骨細胞中Parkin蛋白表達情況(Western bloはing)Fig.6 Expression of Parkin protein in each group of osteoclasts(Western blotting)

表3 各組破骨細胞存活率及miR-181a、Parkin蛋白表達水平比較(±s, n=6)Tab.3 Comparison of osteoclast survival rate and the expression levels of miR-181a and Parkin protein in each group (±s, n=6)

表3 各組破骨細胞存活率及miR-181a、Parkin蛋白表達水平比較(±s, n=6)Tab.3 Comparison of osteoclast survival rate and the expression levels of miR-181a and Parkin protein in each group (±s, n=6)

與空白對照組比較，(1)P＜0.05；與si-miR-181a組比較，(2)P＜0.05

組別 細胞存活率(%) miR-181a Parkin蛋白空白對照組 100.09±0.05 1.02±0.11 1.01±0.08 si-miR-181a組 67.36±6.32(1) 0.59±0.05(1) 1.83±0.19(1)si-Parkin組 156.53±9.86(1)(2)1.02±0.10(2) 0.48±0.05(1)(2)si-miR-181a+si-Parkin組105.65±0.28(2) 0.52±0.05(1) 1.03±0.09(2)空載質(zhì)粒對照組 100.02±0.06(2) 1.06±0.10(2) 1.06±0.08(2)

2.6 共轉(zhuǎn)染si-miR-181a和si-Parkin對破骨細胞線粒體自噬的影響 線粒體/溶酶體共定位檢測結(jié)果顯示，空白對照組線粒體與溶酶體存在共定位(顯黃色結(jié)構(gòu))。與空白對照組比較，si-miR-181a組線粒體與溶酶體共定位(黃色區(qū)域)熒光強度升高[(3.83±0.19) MD/mm2vs. (1.68±0.18) MD/mm2，P＜0.05]，線粒體自噬增強，si-Parkin組線粒體與溶酶體共定位減少，黃色區(qū)域熒光強度降低[(0.88±0.08) MD/mm2，P＜0.05]，線粒體自噬減弱。與si-miR-181a組比較，si-miR-181a+si-Parkin組線粒體與自噬溶酶體共定位減少，黃色區(qū)域熒光強度降低[(1.63±0.16) MD/mm2，P＜0.05]，線粒體自噬減弱?？蛰d質(zhì)粒對照組黃色區(qū)域熒光強度[(1.60±0.16) MD/mm2，P＞0.05]與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖7)。

圖7 各組線粒體/溶酶體共定位染色圖(×1000)Fig.7 Mitochondrial/lysosomal colocalization staining map of each group (×1000)

2.7miR-181a與Parkin靶向關(guān)系驗證 miRtarbase預(yù)測結(jié)果顯示，miR-181a與ParkinmRNA的3'UTR存在結(jié)合位點(圖8)。

圖8 miRtarbase軟件預(yù)測miR-181a與Parkin mRNA的結(jié)合位點Fig.8 Binding site of miR-181a and Parkin mRNA predicted with miRtarbase software PARK2即為Parkin

雙熒光素酶報告實驗驗證結(jié)果顯示，與WT組比較，miR-181a-mimics+WT組熒光素酶活性降低(0.40±0.04vs. 1.02±0.10，P＜0.05)；MUT組與miR-181a-mimics+MUT組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.03±0.12vs. 1.01±0.10，P＞0.05) (圖9)。

圖9 各組破骨細胞熒光素酶相對活性比較(±s, n=6)Fig.9 Comparison of the relative activity of luciferase in osteoclasts of each group (±s, n=6)與WT組比較，(1)P＜0.05

3 討 論

絕經(jīng)后OP是最常見的骨代謝異常疾病之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞數(shù)量及骨吸收活性增加是引起OP骨量丟失的重要原因之一[13]。線粒體自噬在破骨細胞骨吸收及存活過程中發(fā)揮著重要作用，已有研究證實，破骨細胞骨吸收及降解過程中會釋放溶酶體，激活骨吸收蛋白的表達而降解骨質(zhì)，并誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白LC3定位于破骨細胞褶皺邊緣，促進破骨細胞發(fā)生自噬性死亡[14]；該研究認為，線粒體自噬激活一方面反映了破骨細胞骨吸收活性增強，另一方面可影響破骨細胞的存活，提示干預(yù)破骨細胞線粒體自噬可能是抑制破骨細胞骨吸收活性及存活的潛在機制。目前線粒體自噬對破骨細胞存活的影響尚未明確。PINK1/Parkin通路是調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵通路。在一定應(yīng)激及病理條件下，PINK1可感知線粒體損傷并聚集于線粒體外膜上，促進Parkin轉(zhuǎn)位到線粒體外膜并泛素化線粒體蛋白，誘導(dǎo)p62聚集并與LC3特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)線粒體自噬[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OP大鼠骨量丟失(骨體積分數(shù)、骨密度降低)增加，破骨細胞凋亡率、存活率升高，而破骨細胞中線粒體自噬形成的溶酶體及自噬體增多，PINK1/Parkin自噬通路激活，證實OP大鼠破骨細胞存活數(shù)量增加，可能與線粒體自噬激活有關(guān)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與OP破骨細胞活性增強關(guān)系密切[16]，其中miR-181a可靶向上調(diào)死亡受體相關(guān)蛋白(FasL)的表達，促進破骨細胞的增殖及分化[17]，從而影響OP進程。miR-181a是一種線粒體自噬抑制因子，Goljanek-Whysall等[18]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼功能異常及肌肉萎縮與miR-181a水平降低以及線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、p62、自噬溶酶體底物蛋白-泛素結(jié)合蛋白核自噬受體(sequestosome 1，SQSTM1)積聚有關(guān)，上調(diào)miR-181a可抑制Parkin、p62積聚，改善線粒體質(zhì)量和骨骼肌功能，提示miR-181a可能與線粒體自噬有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a與Parkin之間存在靶向負調(diào)控關(guān)系，OP大鼠破骨細胞中miR-181a、Parkin蛋白表達水平明顯高于正常大鼠，推測Parkin介導(dǎo)的自噬激活可能代償性地促進miR-181a上調(diào)，從而對機體發(fā)揮應(yīng)激保護作用。進一步上調(diào)OP大鼠破骨細胞中miR-181a的表達后，Parkin介導(dǎo)的自噬活性降低，細胞存活率升高、凋亡率降低，推測抑制OP大鼠破骨細胞自噬可促進破骨細胞存活，這與Sharma等[19]的抑制線粒體自噬可減輕細胞過度活化產(chǎn)生的應(yīng)激性損傷從而減緩細胞自噬性死亡的觀點相一致。反之下調(diào)miR-181a的表達后，Parkin介導(dǎo)的自噬進一步被激活(Parkin在線粒體外膜上表達，PINK1、Ub、LAMP2、NIX表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高)，破骨細胞存活率降低，提示OP過程中下調(diào)miR-181a的表達可能會促進破骨細胞發(fā)生自噬性死亡，這與既往研究中下調(diào)miR-181a表達可抑制破骨細胞活性[10]以及自噬過度激活導(dǎo)致細胞能量崩潰死亡[19]等結(jié)論一致。另外，外源性敲除破骨細胞中的Parkin基因，可逆轉(zhuǎn)miR-181a下調(diào)發(fā)揮的促進自噬及促凋亡作用。

綜上所述，上調(diào)OP大鼠破骨細胞中miR-181a的表達可靶向下調(diào)Parkin的表達，抑制線粒體自噬激活，促進破骨細胞存活。這可能為闡明OP破骨細胞骨增殖及存活機制提供了一定的依據(jù)。但本研究尚存在不足之處，如未對線粒體自噬與破骨細胞骨吸收之間的關(guān)系進行研究，而破骨細胞存活及骨吸收的靶向miRNA較多，且影響miR-181a表達改變的上游靶向調(diào)控機制尚不明確，仍需進一步研究。