液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中恩諾沙星殘留量的不確定度評(píng)定

孟千軍 賽麗諾 劉 玉

濰坊市檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濰坊 260000

畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與各類(lèi)抗生素藥物的使用息息相關(guān)，這些抗生素藥物廣泛用于畜牧養(yǎng)殖時(shí)的預(yù)防或疾病治療，以保證產(chǎn)量增加，并降低成本。這些藥物中喹諾酮類(lèi)的抗真菌藥物(Antifungal Drugs)是應(yīng)用非常廣泛、重要的一類(lèi)藥物，以抑制細(xì)菌的DNA回旋酶為機(jī)理，抗菌作用強(qiáng)大，抗菌譜較廣，廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)。研究表明[1～4]，喹諾酮類(lèi)抗真菌藥物不是完全安全的，養(yǎng)殖者或生產(chǎn)企業(yè)沒(méi)有嚴(yán)格遵守停藥期宰殺或者濫用藥物會(huì)導(dǎo)致藥物及其代謝物殘留超標(biāo)，會(huì)對(duì)人體的健康產(chǎn)生不良影響，增加消費(fèi)者的潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)[5]。而在日常的食品監(jiān)督抽檢中，喹諾酮類(lèi)恩諾沙星藥物殘留被檢出的幾率非常大，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)是否合格的臨界值判定情況，這也成為畜肉食用安全關(guān)注的焦點(diǎn)之一。2021年9月實(shí)施的GB 31650-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]中明確規(guī)定了恩諾沙星的限量要求，為了保證畜肉食用安全，靈敏、準(zhǔn)確的藥物殘留檢測(cè)技術(shù)必不可少，而在檢測(cè)結(jié)果與規(guī)定合格限值接近時(shí)，需要給出測(cè)量結(jié)果的可信程度，以明確樣品是否存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

在恩諾沙星等藥物殘留的檢驗(yàn)檢測(cè)工作中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、樣品稱(chēng)取以及樣品凈化過(guò)程等方面，都會(huì)使檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的不確定性。由于檢測(cè)過(guò)程不可避免地存在不確定度，當(dāng)不確定度越小，檢測(cè)結(jié)果可信度越高；反之越低[7～12]。不確定度數(shù)值的大小反映了檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可信度高低，代表檢驗(yàn)檢測(cè)值的可信區(qū)間，若檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果剛好在限量值附近，會(huì)直接與產(chǎn)品的合格判定相關(guān)，對(duì)提高檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量、降低誤判風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[12～15]。

本研究分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.17-2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[16]方法，定量檢測(cè)畜肉中恩諾沙星藥物殘留量，依據(jù) JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[17]和 JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[18]，評(píng)定豬肉中以恩諾沙星為代表的喹諾酮類(lèi)藥物殘留量的不確定度，分析檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的可靠性[19]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肉樣品：空白基質(zhì)，購(gòu)于當(dāng)?shù)氐某?；?yáng)性樣品，實(shí)驗(yàn)室制備。

液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀Xevo TQ-S，美國(guó)沃特世公司；

分析天平MS2204TS，梅特勒-托利多；

渦旋混合器VIBRAX VXR，德國(guó)IKA公司；

氮吹儀N-EVAP，美國(guó)Organomation公司；

冷凍離心機(jī)ST16R，賽默飛世爾公司；

固相萃取裝置，美國(guó)沃特世公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸色譜純，德國(guó)默克；

乙二胺四乙酸二鈉、濃氨水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、氫氧化鈉分析純，國(guó)藥集團(tuán)；

固相萃取柱HLB，美國(guó)沃特世公司；

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，濃度100mg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)?？蒲斜O(jiān)測(cè)所。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

依次吸取的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL于10、100mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋到刻度，得到0.1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.1.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別加入按經(jīng)提取和凈化等相應(yīng)的前處理方法制得的6份的空白試樣殘?jiān)?，加入?fù)溶液定容1mL，依次配制成2、10、50、100、250、500μg/L的基質(zhì)匹配系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.2 樣品前處理

按照GB 31658.17-2021的要求，取稱(chēng)取樣品1.00g，加EDTA緩沖液8mL，勻漿，超聲20min，-2℃、10 000r/min離心5min，收集上清液。殘?jiān)恿姿猁}緩沖液8mL，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，混勻后過(guò)HLB固相萃取柱，收集洗脫液45℃氮?dú)獯蹈?，加?.0mL復(fù)溶液溶解，過(guò)膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件

方法：色譜柱為C18，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為1.0μL，流速為0.3mL/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液+甲醇-乙腈溶液(2+8+0.1%甲酸，體積比)=80+20。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為110℃，霧化溫度為450℃，電離電壓為3.0kV，錐孔氣流速為30L/h，霧化氣流速為1 000L/h。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及錐孔電壓和碰撞能量，見(jiàn)表1。

表1 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中恩諾沙星藥物殘留含量(X)按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

X，試樣中被測(cè)恩諾沙星藥物殘留含量(μg/kg)；

CS，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中恩諾沙星藥物濃度數(shù)值(μg/L)；

A，試樣溶液中恩諾沙星藥物的色譜峰面積；

AS，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中恩諾沙星藥物的色譜峰面積；

V，試樣最終定容體積(mL)；

m，試樣質(zhì)量(g)。

本方法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)由最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性擬合而成，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果分析

2.1 測(cè)量不確定度的來(lái)源分析

多元素回歸分析本檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、試樣稱(chēng)量、體積量取、重復(fù)性、回收率等影響不確定度的相關(guān)因素，存在因果關(guān)系，為不確定度的分量來(lái)源。

2.2 測(cè)量不確定度的評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入不確定度u(C)

2.2.1.1 儲(chǔ)備液的配制過(guò)程引入的不確定度u(C1)

由標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)可知，恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)不確定度均為urel(C1)=0.0400。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u(C2)

分別用1mL單標(biāo)線(xiàn)移液管依次移取1.0mL、100μg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液于100mL、10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到恩諾沙星為0.1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。按照矩形分布處理，數(shù)據(jù)參考JJG 196-2006《常用玻璃量器》[20]和GB/T 12806-2011《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 單標(biāo)線(xiàn)容量瓶》的要求[21]，按照A類(lèi)不確定度評(píng)定，移液管、容量瓶及其溫度波動(dòng)引入的不確定度、儲(chǔ)備液稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋過(guò)程中引入的不確定度

2.2.1.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程產(chǎn)生的不確定度u(C3)

使用20、100、250、1 000μL移液器分別移取2、10、50、100、250、500μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于空白基質(zhì)殘?jiān)?，定容?mL，得到濃度分別為2、10、50、100、250、500ug/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。移液管的刻度誤差參考JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》的要求[22]，按A類(lèi)不確定度評(píng)定。豬肉空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的結(jié)果詳見(jiàn)表3所示。

表3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程中引入的不確定度

2.2.2 試樣稱(chēng)量產(chǎn)生的不確定度u(m)

2.2.3 體積量取產(chǎn)生的測(cè)量不確定度u(V)

2.2.3.1 提取液體積產(chǎn)生的不確定度u(V1)

2.2.3.2 最終定容體積引入的不確定度u(V2)

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合產(chǎn)生的不確定度u(X)

將6種不同濃度的豬肉空白基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各取1.0μL分別重復(fù)3次進(jìn)儀器測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo)(C)，峰面積作為縱坐標(biāo)(A)，采用最小二乘法擬合而成的線(xiàn)性回歸方程則為A=aC+b，檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表4所示。取一豬肉陽(yáng)性樣品，經(jīng)樣品提取、凈化、濃縮后3次重復(fù)進(jìn)儀器測(cè)定測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表5，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合產(chǎn)生的不確定度按(2)式計(jì)算。

(2)

式中：

SR為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差,詳見(jiàn)公式(3)；

a為斜率；

b為截距；

nY為對(duì)樣品溶液CY的測(cè)定次數(shù)，nY=3；

nS為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中6個(gè)基質(zhì)匹配質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3次，nS=6×3=18；

Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的待測(cè)物的峰面積；

Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的待測(cè)物的質(zhì)量濃度；

CY為校準(zhǔn)方程求得的陽(yáng)性樣品溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度；

其中：

(3)

(4)

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果、陽(yáng)性樣品的結(jié)果、曲線(xiàn)擬合引入的不確定度相關(guān)量urel(X)=u(X)/C0，結(jié)果見(jiàn)表4、表5、表6。

表4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果表

表5 陽(yáng)性樣品的結(jié)果

表6 曲線(xiàn)擬合引入的不確定度相關(guān)量

2.2.6 回收率產(chǎn)生的不確定度u(R)

表7 豬肉中恩諾沙星的重復(fù)性和回收率測(cè)定結(jié)果

2.3 合成不確定度

豬肉中恩諾沙星的相對(duì)不確定度分量見(jiàn)圖1所示，若不考慮各不確定度的相關(guān)性，則其合成不確定度按公式(5)計(jì)算，結(jié)果詳見(jiàn)表8。

表8 恩諾沙星測(cè)定不確定度分量

圖1 恩諾沙星測(cè)定不確定度分量圖

Urel=

(5)

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

依據(jù)CNAS-GL006:2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[22]，在95%置信區(qū)間，選擇包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U=urel(X)×2×X，計(jì)算豬肉中恩諾沙星藥物殘留測(cè)定的不確定度，評(píng)定結(jié)果詳見(jiàn)表9。

表9 恩諾沙星測(cè)定不確定度評(píng)定結(jié)果

3 結(jié)論

從豬肉中恩諾沙星藥物殘留的測(cè)量不確定度評(píng)定過(guò)程可知，檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的樣品提取、凈化、液相質(zhì)譜測(cè)定、結(jié)果擬合分析等過(guò)程都會(huì)引入相應(yīng)的不確定度分量。通過(guò)對(duì)豬肉中恩諾沙星檢測(cè)過(guò)程中樣品稱(chēng)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋、豬肉空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、溫度波動(dòng)、重復(fù)性、回收率等因素進(jìn)行綜合考查分析，結(jié)果表明，當(dāng)豬肉中恩諾沙星含量為97.4μg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為16.8μg/kg(k=2)。豬肉恩諾沙星檢測(cè)過(guò)程中引入的較顯著不確定度是標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合，不確定度分別為0.0400、0.0408、0.0385、0.0482，而其他分量引入的不確定度對(duì)結(jié)果影響較小。因此，在日常的檢驗(yàn)檢測(cè)操作過(guò)程中，需重點(diǎn)關(guān)注移液管和移液槍的檢定和體積校準(zhǔn)，提高液質(zhì)檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度點(diǎn)范圍，獲得更好的擬合結(jié)果，最大程度減小測(cè)量的不確定度，從而確保檢測(cè)結(jié)果的有效性，為食品安全提供精準(zhǔn)的技術(shù)保障。