大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎組織細胞焦亡的影響

沈金峰， 朱慧萍， 胡芳， 晏子友， 李云生， 鐘森

（1.溫嶺市第一人民醫(yī)院，浙江溫嶺 317500；2.龍巖市中醫(yī)院，福建龍巖 364000；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330006）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy）是導(dǎo)致慢性腎臟病及終末期腎病的首要原因[1]。細胞程序性死亡在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。細胞焦亡是一種新型的程序性細胞死亡方式，與細胞凋亡、壞死不同，當(dāng)細胞發(fā)生焦亡時，細胞內(nèi)釋放大量物質(zhì)，誘發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，因此又稱細胞炎性壞死[3]。已有研究表明，細胞焦亡是造成糖尿病腎病潛在的炎性發(fā)病機制之一[4]。近年來，以細胞焦亡為切入點，探討糖尿病腎病的潛在治療藥物及其療效機制成為研究熱點。大蒜素（diallyl trisulfide）是從大蒜鱗莖中獲得的揮發(fā)性油狀物，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物[5]，研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗心肌纖維化、降脂、抗腫瘤、抗老年癡呆、抗炎、抗菌、抗氧化、抗感染、保護心血管、保護腎臟等廣泛藥理學(xué)作用，其中，在抗炎方面的研究最為深入[6]。既往有研究表明，大蒜素具有減少糖尿病腎病大鼠蛋白尿和保護腎功能的作用[7]，但其具體干預(yù)機制尚不清楚。基于此，本研究觀察大蒜素對糖尿病腎病大鼠腎組織細胞焦亡的影響，探討大蒜素對糖尿病腎病的干預(yù)機制，以期為大蒜素臨床治療糖尿病腎病提供可靠依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物50只SPF級成年雌性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（浙）20180003。動物適應(yīng)1 周，尿蛋白陰性者方可使用。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22± 3）℃、相對濕度（55±10）%。本實驗方案已通過溫嶺市第一人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物、試劑與儀器大蒜素（分子式：C6H9S3），購自上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號：8239402。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma 公司生產(chǎn)，批號：040M1412；白細胞介素（IL）-1β、IL-18等抗體（美國R&D Systems 公司）；凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）抗體、含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3（NLRP3）抗體（美國CST公司）；Caspase-1抗體（英國Abcam 公司）；GAPDH 抗體（美國Bioworld 公司）。熒光顯微鏡，日本Olympus 公司生產(chǎn)。

1.3 動物分組、造模與給藥將50只大鼠按體質(zhì)量隨機分為假手術(shù)組，模型組，大蒜素低、中、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其他組別大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，除假手術(shù)組外，其他組別大鼠給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg·kg-1，假手術(shù)組大鼠給予一次性腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。72 h后大鼠尾靜脈取血，若隨機血糖≥16.7 mmo·L-1則提示糖尿病造模成功。定期檢測大鼠血糖和24 h 尿蛋白定量水平，24 h 尿蛋白定量＞30 mg 為糖尿病腎病模型成功標(biāo)準(zhǔn)[8]。造模成功后開始灌胃。按照沈映君主編的《中藥藥理學(xué)》[9]中藥實驗用藥選擇換算大鼠用藥劑量，10 倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量給藥。大蒜素高、中、低劑量組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1大蒜素灌胃，假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 大鼠一般情況 每日觀察記錄大鼠的毛發(fā)、攝食量、活動、精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化，每周測量尿量、24 h尿蛋白。

1.4.2 腎臟組織病理學(xué)觀察 沿腎蒂剪下殘余腎臟，10%甲醛固定后，流水沖洗，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，脫蠟，再分別進行HE、Massion 染色，脫水、封片，光鏡下觀察腎臟組織的改變。

1.4.3 二氫乙啶（DHE）熒光探針檢測腎組織活性氧簇（ROS）含量 取腎組織冰凍切片，復(fù)溫至室溫，PBS 洗滌3 次，每次5 min。擦干玻片水漬，將含有DHE的PBS滴加于玻片上，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡觀察腎組織中熒光強度，以熒光強度代表ROS水平。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達 取40 mg大鼠腎組織，加裂解液，研磨，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量法測定蛋白濃度，加熱使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉2 h；分別加入1∶2000 稀 釋 的NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 等一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，滴加電化學(xué)發(fā)光液（ECL）（A 液、B 液按1∶1 混勻），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.4.5 免疫組織化學(xué)檢測腎組織IL-1β、IL-18表達 取腎組織石蠟切片，脫蠟，乙醇梯度水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶。10%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h；滴加IL-1β、IL-18（1∶1000 稀釋）等一抗，4 ℃孵育過夜；二抗（1∶500稀釋）室溫孵育1 h。加入3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，染色30 s，沖洗5 min，乙醇脫水，然后透明，封片。使用ImageJ 軟件分析IL-1β、IL-18陽性表達強弱。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白定量水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠24 h 尿蛋白定量水平下降（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組的24 h 尿蛋白定量水平下降最顯著（P＜0.05）。結(jié)果如圖1所示。

圖1 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較Figure 1 Comparison of 24-hour urinary protein amount among various groups of rats

2.2 各組大鼠腎組織病理變化比較假手術(shù)組大鼠腎臟腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，系膜細胞和基質(zhì)無增生，腎間質(zhì)無炎性細胞浸潤及纖維化。模型組大鼠腎臟腎小球體積增大，系膜細胞和基質(zhì)增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤及纖維化。大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎小球損傷減輕，系膜細胞及基質(zhì)增生減輕，腎小管上皮細胞空泡變性減輕，腎間質(zhì)炎性細胞減少、纖維化減輕，其中，大蒜素高劑量組的腎組織病理損傷最輕。結(jié)果如圖2所示。

圖2 各組大鼠腎組織病理變化比較（×200）Figure 2 Comparison of histopathological changes in the kidney tissue among various groups of rats（×200）

2.3 各組大鼠腎組織ROS水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織ROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組腎組織ROS 水平明顯降低（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組的ROS 水平最低（P＜0.05）。結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 超氧化物陰離子熒光探針（DHE）法檢測各組活性氧簇ROS結(jié)果（×200）Figure 3 Results of ROS in various groups detected by fluorogenic probe dihydroethidium（DHE）（×200）

圖4 各組大鼠腎組織活性氧簇（ROS）水平比較Figure 4 Comparison of ROS level in kidney tissues among various groups of rats

2.4 各組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表達比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表達水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達水平降低（均P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達水平最低（均P＜0.05）。結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β的Western Blot電泳圖Figure 5 Western Blot electrophoretogram of NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-18，IL-1β

圖6 各組大鼠腎組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達水平比較Figure 6 Comparison of the expression levels of NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-18 and IL-1β proteins in kidney tissues among various groups of rats

2.5 各組大鼠腎組織IL-1β、IL-18 陽性表達比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β、IL-18 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎組織IL-1β、IL-18 表達水平降低（P＜0.05）；各劑量組組間比較，大蒜素高劑量組IL-1β、IL-18 表達水平最低（P＜0.05）。結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 各組大鼠腎組織IL-1β、IL-18免疫組織化學(xué)結(jié)果（×200）Figure 7 Immunohistochemistry results of IL-1β and IL-18 in kidney tissues in various groups of rats（×200）

圖8 各組大鼠腎組織IL-1β（A）、IL-18（B）陽性表達比較Figure 8 Comparison of the positive expression of IL-1β（A）and IL-18（B）in kidney tissues among various groups of rats

3 討論

糖尿病腎病（diabetic nephropathy）是糖尿病最常見最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，不但會縮短患者的預(yù)期壽命，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，還會給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)[10-11]。目前，尚無治療糖尿病腎病的特效藥物，主要通過改善患者生活方式、控制血糖、控制血壓、糾正脂質(zhì)代謝紊亂等方式來延緩糖尿病腎病的病情進展。因此，進一步探索糖尿病腎病發(fā)病機制及尋找治療糖尿病腎病的藥物研究具有重要的社會和經(jīng)濟意義。

研究發(fā)現(xiàn)，焦亡在糖尿病腎病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。細胞焦亡（pyroptosis）是一種炎癥小體介導(dǎo)的依賴于Caspase-1 的細胞程序性死亡方式。NLRP3 炎癥小體是細胞內(nèi)的免疫復(fù)合物，通過NOD 受體識別進而激活并釋放Caspase-1，誘導(dǎo)細胞腫脹，胞膜溶解，細胞破裂釋放炎性物質(zhì)（IL-18、IL-1β 等）引起炎癥反應(yīng)[13-14]。當(dāng)細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生過多，激活NLRP3 炎性小體，致使細胞焦亡[15-16]。線粒體是ROS 產(chǎn)生的重要部位，90%內(nèi)源性ROS 由線粒體產(chǎn)生[17]。而腎臟是高耗能器官，富含線粒體，高糖可直接誘導(dǎo)腎小管上皮細胞產(chǎn)生ROS，還可通過晚期糖基化終末產(chǎn)物和細胞因子間接誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生[18]。當(dāng)腎組織ROS增加，ROS 通過NLRP3 誘發(fā)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)細胞焦亡，當(dāng)使用線粒體分裂抑制劑（Mdivi-1）能有效減少ROS 產(chǎn)生，從而抑制腎小管上皮細胞焦亡，保護腎臟功能[19]。高血糖癥所致的糖基化終末產(chǎn)物增加，也是糖尿病腎病氧化應(yīng)激的重要刺激因素，后者促進細胞內(nèi)線粒體分解代謝，導(dǎo)致ROS 積聚并觸發(fā)NLRP3 炎性小體途徑，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生焦亡[20]。Li 等[21]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)ROS 可以降低Caspase-1 水平從而抑制糖尿病腎病腎小管上皮細胞的焦亡。上述研究均證實了ROS 介導(dǎo)的細胞焦亡是糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)鍵因素。

中藥含有豐富抗氧化單體，可用于糖尿病腎病的防治[22]。本項目負責(zé)人長期從事大蒜素治療腎病的研究。大蒜作為藥食同源植物，其營養(yǎng)、藥用成分及功效均得到了廣泛關(guān)注和研究，《本草綱目》記載：其“能達下焦，消水，利大小便……能通幽門，治關(guān)格不通”。說明大蒜可用于治療慢性腎病。大蒜素屬于抗氧化劑，在有機溶劑中能夠捕捉自由基，可保護重要的生物分子不被氧化[23]。對煙曲霉感染的小鼠，已有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可減輕其ROS/NLRP3 途徑所致的自噬和焦亡[24]。因此，我們預(yù)測大蒜素是具有一定潛力的治療糖尿病腎病中藥單體。

本研究結(jié)果顯示：建立的糖尿病腎病模型大鼠腎組織ROS 水平及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達升高，腎組織發(fā)生細胞焦亡；經(jīng)大蒜素治療后糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷減輕，腎組織ROS 水平降低，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達下降，與劑量呈相關(guān)性。提示大蒜素可以通過抑制細胞焦亡有效減輕糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷，從而達到治療糖尿病腎病的目的。

綜上所述，大蒜素能有效減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白，其機制可能與抑制ROS/ NLRP3/Caspase-1通路活化，減輕腎組織細胞焦亡相關(guān)。