基于MAP 的一種新型低毒仿生粘合材料*

成 昭，趙天賜，鄭 蕾，馮凱茵，尉祎雯，程詩雅

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

引 言

海洋生物貽貝，通過足絲腺分泌主要成分為貽貝粘合蛋白（mussel adhesive protein，MAP）的特殊黏液，遇海水后立即固化，形成能夠黏附于巖石、船舶等多種底材表面的黏附盤，表現(xiàn)出強(qiáng)大的生物粘合性能[1,2]。其中，位于MAP 側(cè)鏈二羥基苯丙氨酸結(jié)構(gòu)中的核心粘合單元鄰二酚，具有在水環(huán)境中的離解與帶電特性，能夠與以Fe3+為代表的多種金屬離子作用，從而實(shí)現(xiàn)MAP 在巖石、鋼鐵、玻璃等多種材料表面的粘合[3]。此外，粘合單元鄰二酚具有較高化學(xué)活性[4,5]，還可通過一系列氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)聚合物鏈的鏈間交聯(lián)[6,7]、完成反應(yīng)型聚合粘合，進(jìn)一步強(qiáng)化貽貝粘合蛋白的粘合性能（圖1）。

圖1 兒茶酚的可能粘合機(jī)制[8]Fig. 1 The possible adhesive mechanism of the catechol

在人工合成的粘合材料中，設(shè)計(jì)引入MAP 的鄰二酚粘合單元，借助其生物親合、防水粘合及快速固化性能，能夠降低人工合成材料的細(xì)胞毒性及可能免疫應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)以仿生合成手段改善人工粘合材料的黏附與生物相容性能[9]，得到基于MAP仿生粘合基材的新型人工粘合材料。本論文以聚乙二醇、異佛爾酮二異氰酸酯、包含鄰二酚單元的多巴胺鹽酸鹽為原料，通過高分子基體合成與粘合單元引入的仿生合成路徑，得到一種MAP 型粘合材料，并進(jìn)行合成路線設(shè)計(jì)，以調(diào)控材料結(jié)構(gòu)、簡化合成步驟，同時(shí)，考查材料的熱穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性，初步評(píng)價(jià)該仿生粘合材料在生命體環(huán)境中的安全性和適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：傅里葉變換紅外分光光度計(jì)（TENSOR T-27，KBr 壓片，德國BRUKER）；超導(dǎo)核磁共振波譜儀（AVANCE Ⅲ，400MHz，溶劑DMSO-d6，內(nèi)標(biāo)TMS，德國BRUKER）；凝膠滲透色譜儀（PL-GPC50，美國Agilent Technologie）；熱失重分析儀（PE-TGA7，美國Perkin Elmer）；多功能酶聯(lián)免疫檢測儀（1510 Mwltiskan Go，美國Thermo Fisher）。

試劑：DBTL（dibutyltin dilaurate，二丁基二月桂酸錫），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；PEG 1500 （polyethylene glycol 1500，聚 乙 二 醇1500）、IPDI（isophorone diisocyanate，異佛爾酮二異氰酸酯）、DMPA（dihydroxypropionic acid，二羥甲基丙酸）、DCC（N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺）、多巴胺鹽酸鹽、DMF、三乙胺、DMSO，均購自阿拉丁試劑有限公司，分析純。

合成前的試劑預(yù)處理：PEG 1500、DMPA，于100℃下、減壓干燥3h 后使用；DMF 使用前加入干燥劑無水硫酸鈉、于室溫下攪拌過夜，進(jìn)行初步無水處理，濾除干燥劑后、于90℃減壓蒸餾，棄去前后餾分、收集中間餾分，再加入4A 分子篩，密封、使用；三乙胺使用前加入干燥劑無水硫酸鈉、于室溫下干燥24 h，進(jìn)行初步無水處理，濾除干燥劑后，常壓蒸餾，再加入4A 分子篩，密封、使用。

1.2 合成

設(shè)計(jì)以擴(kuò)鏈、偶聯(lián)為主要合成路徑得到了一種新型MAP 仿生粘合材料，其中，1）擴(kuò)鏈步驟以PEG 1500、IPDI 為初始原料，通過PEG 1500 結(jié)構(gòu)中多羥基單元與IPDI 結(jié)構(gòu)中異氰酸酯基的連接得到聚氨酯預(yù)聚物（化合物1），經(jīng)擴(kuò)鏈劑DMPA、催化劑DBTL 作用，得到平均相對(duì)分子質(zhì)量較小的聚氨酯預(yù)聚物擴(kuò)鏈產(chǎn)物（化合物2）；2）在擴(kuò)鏈產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過功能修飾調(diào)控與碳二亞胺類縮合劑DCC作用，接入鄰二酚粘合單元[10,11]，合成得到目標(biāo)MAP高分子粘合材料（化合物3），實(shí)現(xiàn)MAP 的仿生合成（圖2）。

圖2 MAP 粘合材料的合成路徑Fig. 2 The synthetic route of the MAP adhesive material

目標(biāo)粘合材料（化合物3）基于MAP 結(jié)構(gòu)中鄰二酚粘合單元的粘合機(jī)制、進(jìn)行仿生合成設(shè)計(jì)，能夠初步保證粘合材料的低毒性及生物相容性；同時(shí)，以擴(kuò)鏈與偶聯(lián)為主要合成步驟、進(jìn)行分段調(diào)控法合成，加強(qiáng)了粘合材料合成的可修飾性，能夠使人工粘合材料未來研發(fā)工作中的分節(jié)點(diǎn)合成與功能化修飾進(jìn)一步成為可能。

（1）聚氨酯預(yù)聚物（化合物1）的合成

將預(yù)處理之后的試劑IPDI 與PEG 1500，以物質(zhì)的量之比2∶1.2 進(jìn)行均勻混合，加入經(jīng)除水處理的溶劑DMF 適量，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)6h，再經(jīng)減壓蒸餾得到聚氨酯預(yù)聚物（化合物1），為無色至淺黃色油狀物。

（2）聚氨酯預(yù)聚物擴(kuò)鏈產(chǎn)物（化合物2）的合成

將步驟（1）合成得到的聚氨酯預(yù)聚物（化合物1）、DMPA、DBTL，以物質(zhì)的量之比1∶2∶0.2 進(jìn)行均勻混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)3h，得到聚氨酯預(yù)聚物擴(kuò)鏈產(chǎn)物（化合物2），為無色至淺黃色油狀物。

（3）目標(biāo)MAP 粘合材料（化合物3）的合成

將步驟（2）合成得到的聚氨酯預(yù)聚物擴(kuò)鏈產(chǎn)物（化合物2）、DCC、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺、DMF，以物質(zhì)的量之比1∶0.12∶1∶0.1∶15 進(jìn)行均勻混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)8h，得到粗產(chǎn)物沉淀。再以稀鹽酸（2mol/L）進(jìn)行粗產(chǎn)物沉淀的反復(fù)洗滌、透析，得到目標(biāo)MAP 粘合材料（化合物3），為淺黃色油狀物。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

2.1.1 IR 與枝化率

將合成得到的該新型MAP 粘合材料進(jìn)行KBr壓片與IR 測定，得到如圖3 所示的粘合材料紅外吸收光譜。由圖3 所標(biāo)注的PEG 1500（合成中未加入催化劑DBTL）與PEG 1500+DBTL（合成中加入催化劑DBTL）兩個(gè)系列吸收譜線的對(duì)比可知，通過調(diào)控催化劑DBTL 的加入與否，PEG 1500 與PEG 1500+DBTL 譜線中各官能團(tuán)特征吸收峰的百分透過率呈現(xiàn)明顯差異，從而能夠?qū)φ澈喜牧蟼?cè)鏈中粘合單元多巴胺的引入量做出初步判斷，同時(shí)，能夠?qū)Υ呋瘎〥BTL 影響聚氨酯預(yù)聚物進(jìn)行擴(kuò)鏈反應(yīng)時(shí)的枝化率做出分析，以及進(jìn)一步分析枝化率與MAP材料粘合性能的關(guān)系。在人工粘合材料的未來研發(fā)中，將可通過改變催化劑品類、性能，以及調(diào)控催化劑的加入量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)粘合材料的粘合性、枝化率等性能參數(shù)的進(jìn)一步調(diào)控。

圖3 MAP 粘合材料的紅外吸收光譜Fig. 3 The IR spectra of MAP adhesive material

2.1.21H NMR

以DMSO-d6做溶劑、TMS 為內(nèi)標(biāo)，將合成得到的該新型MAP 粘合材料進(jìn)行1H NMR 測定，得到其核磁共振氫譜（圖4）?；瘜W(xué)位移δ=7.82 處，呈現(xiàn)多巴胺酚羥基中活性H 與酰胺鍵中活性H 的特征位移，說明在MAP 粘合材料的側(cè)鏈，通過聚氨酯預(yù)聚物擴(kuò)鏈產(chǎn)物（化合物2）與多巴胺鹽酸鹽的擴(kuò)鏈反應(yīng)，成功接入了鄰二酚黏性功能單元。

此外，由圖4 所標(biāo)注的PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）-DBTL（合成中加入催化劑DBTL）與PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）（合成中未加入催化劑DBTL）兩個(gè)系列的譜線對(duì)比可知，保持測樣量一致時(shí)，通過調(diào)控催化劑DBTL 的加入與否，PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）-DBTL 與PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）譜線強(qiáng)弱呈現(xiàn)明顯差異，結(jié)合圖3 的IR 分析，能夠?qū)φ澈喜牧现首龀鲞M(jìn)一步的判斷，即催化劑DBTL 能夠顯著提高M(jìn)AP 粘合材料的枝化率，從而進(jìn)一步影響其粘合性能。

2.1.3 GPC

以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)聚合物、DMF（含0.01mol/L溴化鋰）為流動(dòng)相，保持流速1.0mL/min 與40℃的測定條件，進(jìn)行GPC 測定，得到聚合物相對(duì)分子質(zhì)量及其分布（圖5，表1）。由表1 可知，多分散指數(shù)PD=Mw/Mn數(shù)值接近2、聚合材料分布均勻，黏均相對(duì)分子質(zhì)量Mv=2662。

表1 MAP 粘合材料的相對(duì)分子質(zhì)量及分布Table 1 The molecular weight and distribution of MAP adhesive material

圖5 MAP 粘合材料的凝膠滲透色譜Fig. 5 The gel permeation chromatography of MAP adhesive material

2.2 MAP 粘合材料熱穩(wěn)定性分析

氮?dú)鈼l件下，保持升溫速率為20℃/min，控制溫度范圍為40～600℃，取樣5mg，進(jìn)行該MAP 粘合材料的熱失重分析（圖6）?？梢?，該粘合材料具有平滑的熱失重曲線，穩(wěn)定性良好，呈現(xiàn)與彈性體熱穩(wěn)定趨勢的相似性[12,13]。該粘合材料在250～350℃范圍內(nèi)主要存在兩個(gè)熱失重段，分別對(duì)應(yīng)于聚氨酯材料的軟段及硬段結(jié)構(gòu)：軟段熱失重因IPDI 和DMPA 分解而產(chǎn)生，硬段熱失重則是由于PEG 1500的分解所形成[12]。

2.3 MTT 評(píng)價(jià)MAP 粘合材料對(duì)ECV304 細(xì)胞增殖抑制作用

將對(duì)數(shù)生長期的EVC304 細(xì)胞接種于96 孔板，置于37℃、5%CO2及90%濕度條件下，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁，更換新培養(yǎng)基，加入該MAP 粘合材料的DMF 溶液，保證終質(zhì)量濃度分別為125、250、500、1000、2000、4000μg/L，每組濃度設(shè)6 個(gè)平行孔，對(duì)照組加入等體積溶劑。再將96 孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中24h，去除培養(yǎng)基，每孔加入配置好的20μL MTT 溶液和180μL 培養(yǎng)液，培養(yǎng)4h。移去上清液，每孔加入150μL 二甲基亞砜，以60 次/min 的頻率震蕩10min，酶標(biāo)儀測定490nm 處吸光度OD 值[14,15]，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率= (1-OD 實(shí)驗(yàn)/ OD 對(duì)照) ×100%，繪制MAP 粘合材料對(duì)ECV304 細(xì)胞增殖抑制作用曲線，得到圖7。

根據(jù)ISO10993-5.8，以細(xì)胞存活率降低30%以上作為判斷生物材料存在細(xì)胞毒性的依據(jù)[16]。圖7結(jié)果顯示，所合成的MAP 粘合材料呈現(xiàn)低毒性，該材料在ECV304 細(xì)胞中的增殖抑制作用隨濃度增加而增大，當(dāng)其濃度達(dá)到最大測試濃度4000μg/L 時(shí)，對(duì)ECV304 細(xì)胞的增殖抑制作用仍低于30%。在體外活細(xì)胞環(huán)境中，該MAP 粘合材料就其濃度增幅整體而言，呈現(xiàn)較低毒性。

圖7 MAP 粘合材料對(duì)ECV304 細(xì)胞的24h 增殖抑制作用Fig. 7 The anti-proliferative effect of MAP adhesive material on the ECV304 for 24h

3 結(jié) 論

基于MAP 生物粘合機(jī)制，設(shè)計(jì)仿生合成路徑，經(jīng)擴(kuò)鏈、偶聯(lián)得到聚氨酯側(cè)鏈接入鄰二酚粘合單元的一種新型MAP 人工合成粘合材料。以IR、1H NMR、GPC 等表征手段確認(rèn)粘合材料的官能團(tuán)信息與材料結(jié)構(gòu)，通過熱失重分析、MTT 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)該粘合材料的熱穩(wěn)定性與生物安全性。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成得到的MAP 型粘合材料結(jié)構(gòu)符合預(yù)期設(shè)計(jì)，質(zhì)量分布均勻，黏均相對(duì)分子質(zhì)量為2662，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性與低毒性，對(duì)ECV304 細(xì)胞的24h 增殖抑制作用低于30%，具有進(jìn)一步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、進(jìn)行快速粘合修復(fù)的良好前景。

在未來研究工作中，為了進(jìn)一步提升MAP 仿生合成材料的生物安全性、生物相容性及功能性，還可對(duì)合成路徑中的聚氨酯中間體進(jìn)行結(jié)構(gòu)-性能調(diào)控，實(shí)現(xiàn)粘合材料的功能性修飾，復(fù)合以快速止血、促進(jìn)愈合、藥物緩釋等功能，擴(kuò)大MAP 復(fù)合粘合材料的適用性，滿足生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)φ澈戏罅系目焖匍]合創(chuàng)口、免拆線與減少創(chuàng)口換藥次數(shù)等實(shí)際需求。