正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化梔子豉湯口服液中梔子苷和染料木素的提取工藝和制備工藝的研究*

孫思邈，梁雨彤，田 明，王 旭，王秀海，馮月男

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

引 言

梔子豉湯是中醫(yī)經(jīng)典名方，出自《傷寒論》，該方由梔子與淡豆豉組成，多用于更年期抑郁癥，失眠，神經(jīng)衰弱等疾病的治療[1～2]。方中梔子為茜草科植物的果實(shí)，其主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜（苷）類(lèi)、有機(jī)酸酯類(lèi)、萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、揮發(fā)油成分以及一些多糖和各種微量元素[3]，其中環(huán)烯醚萜（苷）類(lèi)中包含梔子苷和京尼平，而京尼平是導(dǎo)致梔子引起不良反應(yīng)的成分之一[4]；淡豆豉為大豆成熟種子經(jīng)發(fā)酵而成的加工品，其主要化學(xué)成分有豐富的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。淡豆豉中的大豆黃素和染料木素含量明顯要高于大豆[5]，因此對(duì)于梔子豉湯中有效成分梔子苷和染料木素的提取對(duì)擴(kuò)大梔子豉湯的臨床應(yīng)用具有重要意義。

梔子豉湯現(xiàn)代仍以湯劑形式用于臨床，該形式的缺點(diǎn)是不便于儲(chǔ)運(yùn)、質(zhì)量控制以及規(guī)?；a(chǎn)。中藥口服液是在湯劑基礎(chǔ)上對(duì)其改進(jìn)并得以發(fā)展的一種方便服用、藥效迅速、吸收快且質(zhì)量可控的新型制劑，市場(chǎng)上口服液形式的產(chǎn)品日漸增多，并在臨床上廣泛應(yīng)用[6～7]。本課題將現(xiàn)代中藥學(xué)與藥劑學(xué)交叉融合，運(yùn)用現(xiàn)代化科學(xué)理論及手段合理地設(shè)計(jì)了梔子豉湯口服液的制備工藝，以梔子中有效成分梔子苷和淡豆豉中有效成分染料木素為考察對(duì)象，以正交試驗(yàn)為方法篩選提取工藝，在保證有效成分最大程度保留的基礎(chǔ)上確立最佳制備工藝，使其更好地適合于臨床應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

梔子，淡豆豉（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供）。

梔子苷、染料木素（貴州迪大科技有限公司）；甲醇（色譜純）、乙腈（DikmaPure）；甲醇（分析純）、乙醇、磷酸（純度100%，天津富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平（ME55，METTLER TOLEDO）；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-A，北京京創(chuàng)泰寧偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；電熱恒溫減壓干燥箱（DHG-9140，上海一恒科技有限公司）；醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500D 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Waters 2487UV 檢測(cè)器，美國(guó)Waters）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的研究

2.1.1 吸水率和浸泡時(shí)間的考察

稱(chēng)取5 份藥材，每份中梔子30g、淡豆豉20g，將藥材破碎，置于燒杯中，各加水400mL，封口，放置，按照表1 中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取1 份樣品，濾除水分，稱(chēng)重，計(jì)算吸水率，結(jié)果如表1 所示。

表1 吸水率和浸泡時(shí)間的考察Table 1 The investigation of water absorption and soaking time

結(jié)果顯示，60min 時(shí)吸水量呈飽和狀態(tài)，吸水率為135%，但為減少誤差和保證藥材的充分浸泡[8]，最終選擇浸泡時(shí)間為75min。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)法考察提取工藝[9～10]

根據(jù)藥材吸水量對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)三個(gè)水平進(jìn)行考察，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝，因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 梔子豉湯提取工藝的正交因素水平Table 2 The orthogonal factor level of Zhizichi decoction extraction technology

梔子30g，淡豆豉20g 按照表2 添加相應(yīng)倍數(shù)的水，浸泡75min 后，回流提取，合并藥液過(guò)濾，濃縮定容至200mL，備用。

2.1.3 梔子苷含量測(cè)定[11]

2.1.3.1 色譜條件

色譜柱SinoChrom（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇（30）∶水（70）∶H3PO4（0.25）；波長(zhǎng):238nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。

2.1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密量取6.35mg 梔子苷對(duì)照品，甲醇溶解并定容至10mL，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液，待用。

2.1.3.3 供試品溶液的制備

精密吸取0.5mL 2.1.2 項(xiàng)下的提取液，先水浴蒸干，后甲醇再使結(jié)晶溶解并定容至25mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，待用。

2.1.3.4 含量測(cè)定

精密量取10μL 梔子苷對(duì)照品溶液和10μL 梔子苷供試品溶液，利用高效液相色譜儀對(duì)梔子苷含量進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.4 染料木素含量測(cè)定[12]

2.1.4.1 色譜條件

色譜柱SinoChrom（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水∶冰乙酸（35∶63∶2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。

2.1.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定2.28mg 染料木素對(duì)照品，甲醇定容至10mL，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品溶液，待用。

2.1.4.3 供試品溶液的制備

同2.1.3.3。

2.1.4.4 含量測(cè)定及結(jié)果

分別取10μL 2.1.4.2 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和10μL 2.1.4.3 項(xiàng)下供試品溶液，用于測(cè)定染料木素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal test results

2.2 結(jié)果處理分析

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，B 因素和C 因素對(duì)有效成分的溶出有顯著性影響，B 因素為主要因素，A 因素對(duì)提取效果的影響最小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故以6倍量水最佳。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際情況，確定A2B1C3為最佳提取組合，即6 倍量水浸泡75min 后加熱回流提取1h，共提取三次，合并提取液，供下一步使用。

2.3 濃縮程度的考察

300g 梔子，200g 淡豆豉，取6 倍量水浸泡75min，提取3 次，每次1h，過(guò)濾，合并3 次濾液后濃縮至2500mL（相當(dāng)于1mL 藥液含0.2g 生藥），取750mL 儲(chǔ)備液（相當(dāng)于150g 生藥），分別濃縮至50mL、60mL、75mL、150mL，即1mL 含生藥材分別為3.0g、2.5g、2g、1.0g。觀察各濃度溶液的濃縮狀態(tài)，于80℃時(shí)測(cè)相對(duì)密度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 濃縮狀態(tài)及相對(duì)密度Table 4 The concentration state and relative density

結(jié)果：當(dāng)提取液濃縮至50mL（1mL 含生藥材3g）時(shí)，濃縮液流動(dòng)性差，掛壁嚴(yán)重，相對(duì)密度無(wú)法測(cè)定，因此選擇60mL 為濃縮體積，每1mL 濃縮液含生藥2.5g 為限度。

2.4 醇濃度的考察[13～14]

將2.1.2 項(xiàng)下儲(chǔ)備液平均分成4 份，每份濃縮至1mL 含生藥材2.5g,濃縮完成后再加入乙醇使?jié)舛确謩e達(dá)到50%、60%、70%、80%，記錄溶液狀態(tài)，沉淀24h，過(guò)濾，回收濾液中的乙醇，濃縮后加水定容至60mL，靜置24h 后記錄每份樣品的溶液狀態(tài)，結(jié)果表明：乙醇濃度的變化對(duì)濃縮藥液的醇沉效果的影響較大，藥液中乙醇濃度為50%或60%時(shí)，醇沉效果不理想，表現(xiàn)為沉淀物與溶液中的沉淀物黏附松散；當(dāng)藥液中乙醇濃度調(diào)整到70%時(shí)，醇沉效果好，表現(xiàn)為沉淀粘結(jié)成團(tuán)，且溶液澄清；而當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，有漂浮物析出。綜合以上結(jié)果，最終選擇相對(duì)密度1.05～1.15（80℃）；醇沉濃度70%為最佳條件。

2.5 矯味劑蔗糖的用量

本品從口服液口感特點(diǎn)以及成品的成本角度出發(fā)，以蔗糖為矯味劑，將2.4 醇沉工藝制備的口服溶液按蔗糖量0%、5%、10%、15%、20%加入藥液，攪拌使其溶化，靜置后品嘗口感。結(jié)果表明，蔗糖的用量不同對(duì)口服液的澄清度及pH 值無(wú)顯著影響，當(dāng)口服液中含15%蔗糖時(shí)味道較好，且符合中國(guó)藥典的規(guī)定，因此蔗糖的用量定為15%（g/mL）。

2.6 制劑處方和工藝確定

梔子豉湯原方中15g 梔子加10g 淡豆豉為一日劑量，按照要求以1000mL 計(jì)算確定處方為梔子300g，淡豆豉200g，制成1000 個(gè)制劑單位（1000mL）。梔子豉湯口服液的規(guī)格為每支20mL，每次1 支，一日2 次。具體制備工藝如下：梔子300g，淡豆豉200g，6 倍量水浸泡75min，回流提取1h，共3 次，提取的藥液濃縮至1.05～1.15（80℃）的相對(duì)密度，加乙醇使?jié)饪s液中乙醇含量達(dá)到70%，攪勻，適宜環(huán)境放置24h，收集上清液，剩余藥液過(guò)濾，將二者合并，回收乙醇，蒸餾水稀釋?zhuān)?50g 蔗糖后蒸餾水定容至1000mL，靜置，過(guò)濾，灌裝，滅菌，得成品。

3 結(jié) 論

本課題在優(yōu)化梔子豉湯口服液中梔子苷和染料木素提取工藝時(shí)，為了保證藥材有效成分的最大程度提取，對(duì)浸泡時(shí)間采取單因素試驗(yàn)進(jìn)行考察，確定了浸泡時(shí)間為75min；以梔子苷和染料木素含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)采取正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行考察，確定了最優(yōu)提取工藝為6 倍水量回流提取1h、共3次；濃縮液的程度對(duì)口服液的存儲(chǔ)及患者的使用口感有較大影響，因此，根據(jù)濃縮狀態(tài)和相對(duì)密度對(duì)濃縮程度進(jìn)行了考察，最終確定了提取液濃縮至60mL，限度1mL 含生藥材2.5g，相對(duì)密度為1.05～1.15；根據(jù)口服液的用藥特點(diǎn)，結(jié)合中藥水提液中含有淀粉，多糖等易沉淀成分存在的影響，故對(duì)提取液進(jìn)行了醇沉條件的篩選，選擇濃縮液經(jīng)乙醇醇沉，濃度為濃縮液的70%；對(duì)矯味劑蔗糖進(jìn)行了用量考察，確定蔗糖含量為15%。實(shí)驗(yàn)確定了梔子豉湯的最優(yōu)制備工藝，該工藝最大程度地提高有效成分梔子苷和染料木素的溶出率，且符合現(xiàn)代提取工藝的要求，建議后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行梔子豉湯口服液的穩(wěn)定性研究與工業(yè)生產(chǎn)測(cè)試相關(guān)實(shí)驗(yàn)，為梔子豉湯口服液的量化生產(chǎn)以及高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化制備流程的建立提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。