植物乳桿菌LBS8強(qiáng)化發(fā)酵腌制白蘿卜的條件優(yōu)化研究

邊名鴻，鄒玉鋒，袁樂梅，許強(qiáng)，唐雪梅

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

白蘿卜為十字花科植物，含有粗纖維、芥子油和淀粉酶等有益物質(zhì)，能助消化、止咳化痰，為食療佳品。腌制白蘿卜是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，深受人們喜愛。在傳統(tǒng)腌制過程中，因鹽含量高、技術(shù)不完善、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題限制了腌制白蘿卜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。

研究表明，以植物乳桿菌為發(fā)酵劑，強(qiáng)化發(fā)酵蔬菜能有效提高產(chǎn)品品質(zhì)[2-3]。植物乳桿菌為同型發(fā)酵乳酸菌，能大量產(chǎn)酸，維持原料的pH，并且在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生特有的乳酸桿菌素，起到維持腸道的菌群平衡、抑制腐敗菌和調(diào)節(jié)心血管等作用[4-6]。高世陽[7]利用植物乳桿菌接種榨菜發(fā)酵，接種發(fā)酵榨菜的各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于自然發(fā)酵產(chǎn)品；汪立平等[8]將植物乳桿菌應(yīng)用于低鹽蘿卜泡菜，比較了不同植物乳桿菌接種發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵蘿卜的差異，結(jié)果證明接種植物乳桿菌能縮短泡菜發(fā)酵時(shí)間；朱珺等[9]從四川泡菜中篩選出一株具有益生特性的植物乳桿菌，研究表明其對(duì)胡蘿卜的口感有一定的改善作用并能顯著提高發(fā)酵中的活菌數(shù)；陳延等[10]將篩選出的功能乳酸菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵蕭山蘿卜干，發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌能降低產(chǎn)品的pH和亞硝酸鹽含量，同時(shí)增加氨基酸態(tài)氮的含量等。然而，榨菜的感官特性不僅取決于原料，還取決于強(qiáng)化發(fā)酵劑的選擇，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。強(qiáng)化發(fā)酵劑是腌制白蘿卜品質(zhì)的一個(gè)重要影響因素，但很少有研究去探索強(qiáng)化發(fā)酵劑對(duì)腌制白蘿卜的影響。

本試驗(yàn)將植物乳桿菌LBS8應(yīng)用于白蘿卜強(qiáng)化發(fā)酵，比較接種乳酸桿菌LBS8和傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的差異。同時(shí)，通過監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中總酸、乳酸菌數(shù)和氨基酸態(tài)氮含量的變化以及腌制成品的感官與理化分析，考察不同含鹽量、溫度、接種量和含水量對(duì)腌制白蘿卜品質(zhì)的影響，優(yōu)化發(fā)酵白蘿卜的發(fā)酵條件，以期為榨菜強(qiáng)化發(fā)酵劑的開發(fā)提供參考依據(jù)，同時(shí)為生產(chǎn)過程中的規(guī)范化、安全化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

韓國(guó)白蘿卜、白菜：市售；植物乳桿菌LBS8：實(shí)驗(yàn)室保藏；MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、甲醛、葡萄糖、酚酞、硫酸銅、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、硼酸鈉、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、冰乙酸：均購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 艾測(cè)科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司；冷凍干燥機(jī) 新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌種子液的制備

將植物乳桿菌接種于菜汁培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3次，再以4000 r/min的速率離心處理15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀物，反復(fù)3次，制成菌濃度為1.0×109CFU/mL的發(fā)酵液。

1.2.2 白蘿卜腌制流程

1.2.2.1 傳統(tǒng)腌制白蘿卜工藝[11-13]

選料→剝菜→清洗→切塊→脫水(含水量30%)→加鹽(12%)→入壇發(fā)酵→封壇后熟→成品。

1.2.2.2 乳酸菌接種腌制白蘿卜發(fā)酵工藝

選料→剝菜→清洗→切塊→熱風(fēng)烘脫水→加鹽腌制12 h→接菌(層層噴灑)→入壇發(fā)酵→封壇后熟→成品。

1.2.3 腌制白蘿卜發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)選擇含鹽量、發(fā)酵溫度、接種量和含水量對(duì)腌制白蘿卜質(zhì)量進(jìn)行研究,單因素試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1?；A(chǔ)發(fā)酵條件：白蘿卜脫水至含水量為50%，用6%的鹽腌制白蘿卜12 h，接入6‰的植物乳桿菌發(fā)酵液，20 ℃培養(yǎng)20 d。當(dāng)改變其中一個(gè)因素變量時(shí)，其他因素水平保持不變。

1.2.4 腌制白蘿卜工藝正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，腌制白蘿卜受含鹽量(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)和含水量(D)的影響均較大，選擇這4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分、硬度、酸度、乳酸菌素、氨基酸態(tài)氮含量為評(píng)定指標(biāo)，以腌制白蘿卜的綜合評(píng)分確定出最佳的低鹽腌制白蘿卜工藝[14-16]，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and leves of orthogonal experiment design

1.2.5 相關(guān)參數(shù)的分析方法

1.2.5.1 酸度

按照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008測(cè)定腌制白蘿卜的酸度，以乳酸計(jì)。

1.2.5.2 乳酸菌數(shù)

取25 g腌制白蘿卜，加入225 mL無菌生理鹽水，振蕩30 min后進(jìn)行梯度稀釋，選擇2～3個(gè)適宜的稀釋樣液，涂布于2個(gè)無菌MRS平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5.3 氨基酸態(tài)氮

按照國(guó)標(biāo)GB 5009.235—2016中的酸度計(jì)法對(duì)腌制白蘿卜中的氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5.4 含水量

按照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016中的直接干燥法對(duì)白蘿卜的水分含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5.5 感官評(píng)定

采用百分制對(duì)腌制白蘿卜的色澤、香氣、質(zhì)地、滋味這4大類12小類進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 腌制白蘿卜感官品評(píng)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards for pickled white radish

1.2.5.6 硬度測(cè)定

樣品處理為1 cm3的正方體。選用P/2探頭，圖像最高點(diǎn)的數(shù)值為腌制白蘿卜的硬度。測(cè)前速度2 mm/s，測(cè)中速度1 mm/s，測(cè)后速度1 mm/s，壓縮比例為70%，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.2.5.7 綜合評(píng)分計(jì)算

將試驗(yàn)的5個(gè)指標(biāo)——總酸、乳酸菌數(shù)、氨基酸態(tài)氮含量、感官評(píng)分和硬度參照黃珊[17]的評(píng)價(jià)方法，運(yùn)用隸屬度的綜合評(píng)分法，對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)分。

1.2.5.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

參照Aurelia M P等[18]和Li M等[19]的研究方法，并稍作修改測(cè)定還原能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。得到的數(shù)據(jù)使用SPSS進(jìn)行ANOVA方差分析和鄧肯多重?cái)?shù)據(jù)分析，在P<0.05(n=3)的條件下進(jìn)行差異顯著性分析。利用Origin作圖，不同的英文字母表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 含鹽量對(duì)腌制白蘿卜的影響

圖1 不同含鹽量對(duì)腌制白蘿卜的影響Fig.1 Effect of different salt content on pickled white radish

圖2 不同含鹽量腌制白蘿卜硬度的影響Fig.2 Effect of different salt content on hardness of pickled white radish

含鹽量是腌制食品中的一個(gè)重要影響因素[20]。由圖1可知，隨著含鹽量的增加，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數(shù)隨之降低。乳酸菌可以抑制腐敗菌的滋生，賦予腌菜獨(dú)特的風(fēng)味和提升腌菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[21-22]。2%、4%和6%加鹽量產(chǎn)品的酸度和乳酸菌數(shù)差異較小，酸度在3.69～3.91 g/kg之間，乳酸菌數(shù)在8.86～10.7 log CFU/mL之間，且顯著大于傳統(tǒng)腌制產(chǎn)品。氨基酸態(tài)氮也隨著含鹽量的增加而減小，當(dāng)含鹽量為6%時(shí)，感官評(píng)分最高，氨基酸態(tài)氮含量為0.048 g/100 g，超過6%時(shí)，下降速率增加，可能是由于鹽度過高導(dǎo)致腌制白蘿卜中的氨基酸態(tài)氮因滲透作用流出，被微生物利用。含鹽量為6%時(shí)，腌制白蘿卜的感官評(píng)分最高，硬度也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)腌制白蘿卜的影響

由圖3可知，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數(shù)隨著溫度的上升而增加，當(dāng)發(fā)酵溫度超過15 ℃時(shí)，酸度增加較快，之后趨于平緩,維持在3.69～4.13 g/kg之間。乳酸菌數(shù)在20 ℃之后變化不大，維持在8.86～8.94 log CFU/mL之間。氨基酸態(tài)氮隨著發(fā)酵溫度的增加而增加，之后有所下降，原因可能是白蘿卜中的蛋白質(zhì)被微生物分泌的蛋白酶降解為氨基酸等物質(zhì)，因滲透作用流出而被微生物利用[23-24]。腌制白蘿卜的硬度隨著溫度的上升而增加，當(dāng)溫度在25 ℃時(shí)，腌制白蘿卜的硬度達(dá)到了較高的水平，由于果膠甲酯酶的活性逐漸上升，果膠甲酯酶可將蔬菜中的高甲氧基果膠(HM)轉(zhuǎn)化成低甲氧基果膠(LM)，使 LM與鈣離子發(fā)生交聯(lián)作用，產(chǎn)生一種堅(jiān)固的果膠酸鈣網(wǎng)絡(luò)來保持蔬菜的脆度[25]。腌制白蘿卜在發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)的感官評(píng)分最高，但與25 ℃溫度發(fā)酵的產(chǎn)品相差較小，分別為93.3分和91.3分，且25 ℃的腌制白蘿卜硬度較高。綜合考慮，以25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)腌制白蘿卜的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on pickled white radish

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)腌制白蘿卜硬度的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on hardness of pickled white radish

2.3 接種量對(duì)腌制白蘿卜的影響

圖5 不同接種量對(duì)腌制白蘿卜的影響Fig.5 Effect of different inoculation amount on pickled white radish

圖6 不同接種量對(duì)腌制白蘿卜硬度的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on hardness of pickled radish

由圖5可知，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量超過8‰時(shí)，酸度及乳酸菌數(shù)趨于平緩，但氨基酸態(tài)氮卻在上升，游離的氨基酸態(tài)氮增多，發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值隨之增高。接種量為6‰時(shí)感官評(píng)分最高，為93.3分，但相較于10‰接種量的感官評(píng)分差異較小，為91.9分。此外，接種量超過4‰時(shí)，菜皮和菜心的硬度下降，原因可能是酸度過高，導(dǎo)致其生成的果膠酸減少，相應(yīng)生成的果膠酸鈣降低[26],但發(fā)酵產(chǎn)品菜心的硬度都高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。因此，植物乳桿菌強(qiáng)化白蘿卜發(fā)酵，有利于腌制白蘿卜硬度的保持。綜合考慮，以10‰為最佳接種量。

2.4 含水量對(duì)腌制白蘿卜的影響

圖7 不同含水量對(duì)腌制白蘿卜影響Fig.7 Effect of different water content on pickled white radish

圖8 不同含水量的腌制白蘿卜硬度的影響Fig.8 Effect of different water content on hardness of pickled white radish

由圖7可知，隨著含水量的增加，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數(shù)隨之增加。當(dāng)含水量超過50%時(shí)，腌制白蘿卜的酸度和乳酸菌數(shù)趨于平穩(wěn)，分別維持在3.69～3.96 g/kg和8.86～8.96 log CFU/mL之間。當(dāng)含水量小于50%時(shí)，腌制白蘿卜的感官評(píng)分隨著含水量的增加而增加，但超過50%后，感官評(píng)分下降。隨著含水量的增加，氨基酸態(tài)氮含量也在增加，且當(dāng)含水量超過50%后，其含量增加明顯。原因可能是白蘿卜在脫水過程中產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，與丙氨酸、脯氨酸、GABA和谷氨酸代謝相關(guān)的酶活性在脫水過程中保持其活性，在制備過程中積累了丙氨酸、脯氨酸和GABA等氨基酸，且具有良好的口感和保健作用[27]。綜合考慮，以含水量50%為最佳含水量。

2.5 腌制白蘿卜工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

分別對(duì)4個(gè)因素：含鹽量(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)和含水量(D)進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討各因素對(duì)腌制白蘿卜的協(xié)同影響，以腌制白蘿卜產(chǎn)品的綜合評(píng)分為指標(biāo)，優(yōu)化腌制白蘿卜工藝。試驗(yàn)各指標(biāo)數(shù)據(jù)見表4～表6。

表4 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment optimization

表5 各指標(biāo)下的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)表Table 5 Orthogonal experiment data under each index

表6 各指標(biāo)下正交試驗(yàn)的隸屬度和綜合評(píng)分表Table 6 Membership degree and comprehensive scores of orthogonal experiment under each index

由表4中的極差R值可知，影響綜合評(píng)分的因素為A>C>D>B，即含鹽量>接種量>含水量>發(fā)酵溫度；其最佳工藝條件為A2B3C1D1，即含鹽量6%，發(fā)酵溫度27 ℃，接種量9‰，含水量45%。

2.6 傳統(tǒng)與強(qiáng)化發(fā)酵白蘿卜質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)比分析

表7 不同發(fā)酵方式腌制白蘿卜的評(píng)價(jià)指標(biāo)值Table 7 Evaluation index values of pickled white radish by different fermentation methods

由表7可知，最佳工藝條件下腌制白蘿卜的酸度、乳酸菌數(shù)、氨基酸態(tài)氮、感官評(píng)分、菜皮和菜心硬度顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品，亞硝酸鹽含量低于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品。最佳工藝產(chǎn)品的還原能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品。本試驗(yàn)最佳工藝產(chǎn)品的抗氧化性與武晉海等的無預(yù)腌漬產(chǎn)品的抗氧化性相同[28]。在此發(fā)酵工藝下，腌制白蘿卜酸度適中，硬度較好，有腌制白蘿卜特有的琥珀色和香味，綜合品質(zhì)較好。初步說明功能菌LBS8強(qiáng)化發(fā)酵在保證腌制白蘿卜感官品質(zhì)的前提下，具有一定的降解產(chǎn)品中亞硝酸鹽和提高產(chǎn)品抗氧化能力的作用。

3 結(jié)論

綜上所述，以植物乳桿菌LBS8強(qiáng)化發(fā)酵腌制白蘿卜對(duì)其品質(zhì)影響較大，通過接種強(qiáng)化發(fā)酵劑發(fā)酵白蘿卜較自然發(fā)酵能有效提升其產(chǎn)品質(zhì)量，不論是硬度還是感官評(píng)分都顯著提升。研究發(fā)現(xiàn)，含鹽量、發(fā)酵溫度、接種量和含水量對(duì)腌制白蘿卜的品質(zhì)均有影響，并通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，得出植物乳桿菌LBS8強(qiáng)化發(fā)酵白蘿卜的最佳發(fā)酵條件為：含鹽量6%，發(fā)酵溫度27 ℃，接種量9‰，含水量45%。在該條件下發(fā)酵的腌制白蘿卜酸度適中，硬度較好，有腌制白蘿卜特有的琥珀色和香味，綜合品質(zhì)較好。酸度、乳酸菌數(shù)、氨基酸態(tài)氮含量、感官評(píng)分、菜皮硬度、菜心硬度顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品；亞硝酸鹽含量為0.20 mg/kg，顯著低于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品；還原能力為119.28 μmol/L，羥自由基清除能力為39.46%，超氧陰離子自由基清除能力為78.74%，DPPH自由基清除能力為40.12%，均顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品。本研究為微生物強(qiáng)化發(fā)酵腌制蔬菜食品提供了一定的數(shù)據(jù)參考，為提高傳統(tǒng)腌制蔬菜食品的穩(wěn)定性及工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了一定思路。