超聲輔助提取迷迭香抗氧化劑工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

鄧慧，王瑩，曾祥輝，王瑛，楊夢男

(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)為雙葉子植物，是唇形科迷迭香屬的常綠小灌木，原產(chǎn)于歐洲、地中海沿岸[1-2]。迷迭香富含多種化學成分，鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚和迷迭香酸是迷迭香主要的活性物質(zhì)[3-5]，據(jù)報道，迷迭香有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[6-8]。

目前植物抗氧化成分提取方法主要有回流法、溶劑提取法、超聲波輔助法、微波輔助法、超臨界流體萃取法等[9-15]，針對迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑的研究鮮有報道。本文采用單因素及響應(yīng)面試驗，在超聲輔助提取條件下，分別確定迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑的最佳提取工藝條件；通過DPPH、ABTS+自由基清除率及鐵還原力，并以Vc為陽性對照評價其體外抗氧化能力，以期為開發(fā)新型天然脂溶性、水溶性抗氧化劑的研究提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香：由湖南省邵東市迷迭香種植基地提供，干葉經(jīng)低溫烘干、粉碎、過40目篩備用。

乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(色譜純)；鼠尾草酸標準品、迷迭香酸標準品：HPLC純度≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司；DPPH：純度≥97%，酷爾化學科技(北京)有限公司；ABTS：純度≥98%，哈爾濱如吉科技有限公司；乙醇、過硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸等：均為分析純。

FW高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；CP114分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；TD4臺式離心機 湖南赫西儀器設(shè)備有限公司；U3000高效液相色譜儀 ThermoFisher Scientific公司；SB-700DTY超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；H2-16K真空冷凍干燥器 重慶市松朗電子儀器有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 迷迭香提取液的制備

迷迭香粉末按一定料液比加入一定濃度的乙醇溶劑，在一定溫度下提取一定時間，經(jīng)10000 r/min離心15 min，取上清液定容。

1.2.2 脂溶性抗氧化劑測定

參照文獻[16]，采用高效液相色譜法測定迷迭香脂溶性抗氧化劑總得率，按下式計算得率(Y1)：

式中：C1為鼠尾草酸含量，mg/mL；C2為鼠尾草酚含量，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為試樣質(zhì)量，mg。

1.2.3 水溶性抗氧化劑測定

參照GB 1886.172-2016，采用高相液相色譜法測定迷迭香水溶性抗氧化劑得率，按下式計算得率(Y2)：

式中：C為迷迭香酸含量，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為試樣質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素試驗

稱取迷迭香粉末，根據(jù)參考文獻[17]，超聲功率為210 W，以乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度為因變量，分別對迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑得率進行單因素試驗。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計對迷迭香脂溶性和水溶性抗氧化劑含量提取條件進行優(yōu)化，以乙醇濃度、料液比、提取時間及提取溫度為自變量，以抗氧化劑含量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的優(yōu)化試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1和表2。

表1 脂溶性抗氧化劑提取試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of fat-soluble antioxidant extraction test design

表2 水溶性抗氧化劑提取試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of water-soluble antioxidant extraction test design

1.2.6 迷迭香粗提取物體外抗氧化性能的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻[18]略有改動，取不同質(zhì)量濃度的樣液和0.1 mmol/L DPPH-乙醇均勻混合，室溫下避光反應(yīng)后，于517 nm處測定吸光度，以Vc為陽性對照，根據(jù)下式計算自由基清除率：

式中：A為樣品液吸光度；A0為空白吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻[19]并稍作改動，取不同質(zhì)量濃度的樣液，加入ABTS+工作液，混合搖勻。室溫條件反應(yīng)后，于734 nm處測定吸光度，以Vc為陽性對照，根據(jù)下式計算自由基清除率：

式中：A為樣品液吸光度；A0為空白吸光度。

1.2.6.3 鐵還原力測定

參照文獻[20]并稍作改動，取不同質(zhì)量濃度的樣液，加入磷酸緩沖溶液(pH 6.6，0.2 mol/L)和1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻水浴20 min，冷卻后加入10%三氯乙酸溶液，離心10 min，吸取上清液加入0.1%三氯化鐵，于700 nm處測定吸光度，以Vc作為陽性對照，用吸光度值表示還原能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，并利用Origin 2018和Design-Expert 10.0.7、Prism 8.0數(shù)據(jù)軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

在迷迭香脂溶性、水溶性乙醇體積分數(shù)分別為80%、40%，料液比為1∶30，提取時間為50 min，提取溫度為50 ℃的條件下，結(jié)果見圖1。

a

b

c

d

由圖1中a可知，隨著乙醇濃度的增大，迷迭香抗氧化劑得率先增大后減小，可能是乙醇濃度的增加增強了細胞的穿透力，促進了溶劑滲透，從而提高了得率。迷迭香脂溶性抗氧化劑在乙醇濃度為60%時達到最大值，乙醇濃度過高導(dǎo)致滲透壓過高，影響植物組織中脂溶性物質(zhì)的溶出。而迷迭香水溶性抗氧化劑在40%時達到最大值，可能是溶劑極性下降，使水溶性抗氧化劑溶出減少，醇溶性的雜質(zhì)溶出增多，影響其得率。綜合考慮，脂溶性抗氧化劑選用60%乙醇體積分數(shù)，水溶性抗氧化劑選用40%乙醇體積分數(shù)。

由圖1中b可知，迷迭香抗氧化劑得率隨著料液比的增加而不斷升高。增大迷迭香與提取溶劑的接觸面積，有利于迷迭香抗氧化物質(zhì)溶出。但當料液比達到1∶30后抗氧化劑得率緩慢下降，表明提取已趨于穩(wěn)定。而料液比過大，后續(xù)濃縮耗能加大。從降低成本、節(jié)約能源角度考慮，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑的料液比均選用1∶30。

由圖1中c可知，迷迭香抗氧化劑得率隨著提取時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當提取時間達到50 min時，迷迭香抗氧化劑得率達到最大。但再延長提取時間，迷迭香抗氧化劑得率下降，抗氧化成分可能已被提取出來，過長時間的加熱提取使抗氧化成分結(jié)構(gòu)遭到破壞，發(fā)生降解，從而導(dǎo)致得率下降；此外，長時間提取會造成一定的資源浪費，故迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑均選取提取時間為50 min。

由圖1中d可知，隨著提取溫度的升高，迷迭香抗氧化劑得率逐漸升高，溫度升高可能會加快分子間的運動速度，使細胞壁的滲透性增強，增加迷迭香抗氧化劑的溶出，從而提高得率。脂溶性抗氧化劑得率在50 ℃時達到最大值，而水溶性抗氧化劑得率在60 ℃時達到最大值。當溫度繼續(xù)升高，迷迭香抗氧化劑得率開始降低，在高溫條件下分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，加速物質(zhì)氧化及降解，導(dǎo)致迷迭香抗氧化劑得率降低。因此，脂溶性抗氧化劑選用提取溫度為50 ℃，水溶性抗氧化劑選用溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，分別以脂溶性、水溶性抗氧化劑得率為響應(yīng)值，選取乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素為評價因素，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗測定結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Response surface experiment design scheme and results

續(xù) 表

2.2.1 模擬方差分析劑響應(yīng)面試驗結(jié)果

對表3中試驗數(shù)據(jù)進行擬合，迷迭香脂溶性抗氧化劑得率的回歸多元方程為Y1=5.39+0.11A+0.13B+0.13C-0.078D+0.023AB+0.2AC+0.083AD+0.13BC-0.037BD+0.11CD-0.82A2-0.41B2-0.77C2-0.24D2。

迷迭香水溶性抗氧化劑得率的回歸多元方程為：Y2=0.76+0.018A+0.003167B+0.018C+0.003667D+0.012AB-0.019AC-0.022AD-0.009BC+0.012BD-0.0015CD-0.098A2-0.057B2-0.071C2-0.047D2。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equations

續(xù) 表

由表4可知，迷迭香脂溶性抗氧化劑得率模型回歸具有高度的顯著性(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.0865>0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9929，校正決定系數(shù)R2=0.9858，說明該模型擬合度高，可利用此回歸方程預(yù)測迷迭香脂溶性抗氧化劑的最佳提取工藝。模型中A、B、C、D、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2差異極顯著，AD差異較顯著，其余項差異均不顯著，根據(jù)F值可知，4個因素對得率的影響程度為料液比(B)>提取時間(C)>乙醇濃度(A)>提取溫度(D)。

迷迭香水溶性抗氧化劑得率回歸模型具有高度的顯著性(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.5036>0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9943，校正決定系數(shù)R2=0.9886，表明該模型擬合度高。模型中A、C、AB、AC、AD、A2、B2、C2、D2差異極顯著，BC差異較顯著，其余項差異均不顯著?？衫么嘶貧w方程預(yù)測迷迭香水溶性抗氧化劑的最佳提取工藝。根據(jù)F值可知，4個因素對水溶性抗氧化劑得率的影響程度為乙醇濃度(A)>提取時間(C)>提取溫度(D)>料液比(B)。

2.2.2 提取工藝優(yōu)化及驗證試驗

通過Design-Expert 10.0.3軟件分析得到最佳的提取工藝條件：乙醇濃度61%、料液比1∶32、提取時間51 min、提取溫度49 ℃，迷迭香脂溶性抗氧化劑得率預(yù)測值可達5.418%，進行3次平行試驗驗證，得到平均得率實際值為5.401%，與預(yù)測值接近，表明該模型具有較好的預(yù)測性能；迷迭香水溶性抗氧化劑的最佳提取條件：乙醇濃度42%、料液比1∶30、提取時間52 min、提取溫度60 ℃，此時的迷迭香水溶性抗氧化劑得率預(yù)測值為0.764%，在最佳的提取條件下，進行3次平行試驗驗證，迷迭香水溶性抗氧化劑得率平均為0.755%，與預(yù)測值接近，表明該模型具有一定的可靠性。

2.3 迷迭香抗氧化劑體外抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH清除能力

由圖2可知，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑對DPPH具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力呈上升趨勢，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑在較低濃度時對DPPH自由基的清除能力低于Vc，但當質(zhì)量濃度大于0.08 mg/mL時，其抑制效果逐漸接近Vc。迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑和Vc清除自由基的IC50分別為0.0293，0.0454，0.0101 mg/mL，可看出迷迭香脂溶性抗氧化劑的清除能力強于水溶性抗氧化劑，但稍弱于Vc。

圖2 迷迭香抗氧化劑DPPH自由基清除效果Fig.2 Scavenging effect of antioxidants from Rosmarinus officinalis on DPPH radicals

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

圖3 迷迭香抗氧化劑ABTS+自由基清除效果Fig.3 Scavenging effect of antioxidants from Rosmarinus officinalis on ABTS+ radicals

由圖3可知，隨著濃度的增加，其對ABTS+自由基的清除能力逐漸增強，在低濃度時，迷迭香水溶性的清除自由基能力低于脂溶性和Vc，當質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑和Vc對ABTS+自由基的清除率分別達到92.86%、86.4%和96.7%。它們?nèi)叩腎C50分別為0.0617，0.1334，0.04035 mg/mL。說明迷迭香脂溶性抗氧化劑對ABTS+自由基的清除能力強于水溶性抗氧化劑，但稍弱于Vc。

2.3.3 鐵還原力

圖4 迷迭香抗氧化劑鐵還原力Fig.4 Iron reducing power of antioxidants from Rosmarinus officinalis

吸光度值可表示其還原能力的強弱[21]。由圖4可知，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑和Vc的吸光度值均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而上升，說明迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑均具有一定的還原能力。其中迷迭香脂溶性抗氧化劑的還原能力較強于水溶性抗氧化劑，但二者與Vc相比還原力較弱。

3 結(jié)論

本研究對迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑的提取工藝進行優(yōu)化，并對其抗氧化活性進行研究。通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，建立乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度四因素三水平的回歸模型擬合方程，最終確定迷迭香脂溶性抗氧化劑的最優(yōu)條件為乙醇濃度61%、料液比1∶32、提取時間51 min、提取溫度49 ℃，得率為5.401%；水溶性抗氧化劑的最優(yōu)條件為乙醇濃度42%、料液比1∶30、提取時間52 min、提取溫度60 ℃，得率為0.755%。

此外，相同質(zhì)量濃度條件下，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化劑與Vc溶液對DPPH自由基的清除能力均強于ABTS+自由基清除能力。綜合比較3種體外抗氧化活性評價指標，迷迭香脂溶性、水溶性提取物均表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。