藏紅花素對(duì)慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠肺組織NOD樣受體蛋白3表達(dá)及血清IL-1β水平的影響

王海賀，王 璐，李 玲，王武龍

(1.巴彥淖爾市醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由氣道和肺實(shí)質(zhì)慢性炎癥引起的以進(jìn)行性氣流受限為特征的疾病。目前西醫(yī)治療COPD多采用支氣管擴(kuò)張劑、抗生素聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療，可暫時(shí)緩解癥狀，但是COPD反復(fù)發(fā)作，難以痊愈，預(yù)后較差[1]。因此，尋找有效的治療方法改善COPD患者預(yù)后尤為迫切。中醫(yī)認(rèn)為肺為嬌臟，容易感邪，遷延失治，痰瘀稽留，損傷正氣，急性加重期以實(shí)為主，表現(xiàn)為痰熱，治法為清肺化痰、降逆平喘。藏紅花是名貴中藥材，其具有祛痰、鎮(zhèn)靜、解痙的作用。藏紅花素是藏紅花的活性成分，其通過(guò)抗氧化、抗炎機(jī)制對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥及其心臟毒性具有一定預(yù)防作用[2]。藏紅花素可抑制COPD大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡，改善氣道炎癥。NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，可促進(jìn)產(chǎn)生白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β等促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而誘發(fā)加重COPD氣道炎癥[3-4]。目前煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖，結(jié)合鼻腔給菌是誘導(dǎo)COPD急性加重期大鼠模型的重要方法[5]。本研究擬通過(guò)NLRP3探討藏紅花素對(duì)COPD急性加重期大鼠肺功能和炎癥反應(yīng)的影響，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于24～25 ℃，濕度50%，光照、黑暗各12 h的動(dòng)物房中，自由采食和飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：藏紅花素(批號(hào)YY90210)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C1091)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)S0131)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)釋放檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C0017)、磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔單抗(批號(hào)AF1186)、NLRP3兔單抗(批號(hào)AF2155)、山羊抗兔IgG(批號(hào)A0208)、Trizol(批號(hào)R0016)、大鼠IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)P1303)購(gòu)自上海碧云天生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 COPD加重期模型的制備：參照煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖，并結(jié)合鼻腔給菌法建立COPD急性加重期模型，即在實(shí)驗(yàn)第1～28天(除7、14、28 d外)將大鼠放置于玻璃煙熏箱，5%煙霧濃度煙熏30 min，然后將大鼠轉(zhuǎn)移到正常環(huán)境中飼養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)第7、14、28天，在氣管內(nèi)滴入0.2 ml濃度為1 g/L的內(nèi)毒素。第29～32天，鼻腔內(nèi)滴注0.3 ml 2.4×109CFU/ml的金黃色葡萄球菌溶液，2次/d[5]。對(duì)照組大鼠氣道和鼻腔內(nèi)每次滴注等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 分組和給藥：將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、藏紅花素小劑量組(10 mg/kg藏紅花素)、藏紅花素大劑量組(50 mg/kg藏紅花素)，每組10只。在實(shí)驗(yàn)第4天煙熏前1 h，藏紅花素小、大劑量組大鼠分別腹腔注射10、50 mg/kg的藏紅花素溶液[6]，每日1次，直到造模結(jié)束。造模結(jié)束24 h后進(jìn)行肺功能檢測(cè)，抽取動(dòng)脈血，摘取肺組織。

1.2.3 肺功能指標(biāo)檢測(cè)：用10%水合氯醛腹膜內(nèi)麻醉大鼠，固定頭部和四肢，頸部消毒后，鈍性逐層分離頸部皮下組織直至氣管暴露，氣管插管，連接FGC-A+型全自動(dòng)肺功能測(cè)試儀，記錄大鼠的0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)、呼氣峰流量(Peak expiratory flow，PEF)以及吸氣峰流量(Peak inspirator flow，PIF)[7]。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡：將肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，隨后切成4 μm厚組織切片。二甲苯脫蠟后，入梯度乙醇直至水化。按照TUNEL試劑盒步驟染色。每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，以凋亡細(xì)胞和視野總細(xì)胞數(shù)目的比值表示細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 比色法檢測(cè)大鼠血清MDA、LDH水平：抽取大鼠動(dòng)脈血，25 ℃靜置60 min，2000 r/min離心20 min后分離血清，采用MDA檢測(cè)試劑盒、LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠血清MDA、LDH水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)肺組織NLRP3蛋白表達(dá)：RIPA法提取肺組織總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉封閉，隨后依次加入一抗(NLRP3抗體1∶1000稀釋，GAPDH抗體1∶2000稀釋)和二抗(1∶1000稀釋)進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的相對(duì)灰度值。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)大鼠肺組織NLRP3 mRNA表達(dá)：以Trizol試劑提取肺組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用SYBR Green Master Mix配制20 μl反應(yīng)體系，采用CFX96 Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)NLRP3 mRNA表達(dá)。用2-△△Ct法分析NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。NLRP3上游引物5’-CAGCGATCAACAGGCGAGAC-3’，下游引物5’-AGAGATATCCCAGCAAACCTATCCA-3’；GAPDH上游引物5’-GAACATCATCCCTGCATCCA-3’，下游引物CCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’。

1.2.8 ELISA檢測(cè)血清IL-1β水平：按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、模型組和藏紅花素小、大劑量組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡率分別是(2.99±0.14)%、(35.05±2.28)%、(24.40±1.32)%、(11.21±0.86)%。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.3 各組大鼠血清MDA、LDH水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA和LDH水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠血清MDA和LDH水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清MDA、LDH水平比較

2.4 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠肺組織中NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3(圖2)。

表3 各組大鼠肺組織NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表達(dá)比較

圖2 各組大鼠肺組織NLRP3蛋白表達(dá)

2.5 各組大鼠血清IL-1β水平比較 干預(yù)后，對(duì)照組、模型組及藏紅花素小、大劑量組大鼠血清IL-1β水平分別為(50.14±1.66)、(273.61±18.73)、(188.83±14.20)、(92.52±9.07)pg/ml。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素小、大劑量組大鼠血清IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

慢性支氣管炎和氣道阻塞是COPD的主要病理特征，吸煙、感染等有害刺激可誘發(fā)肺部異常炎癥，加重COPD患者呼吸道癥狀，降低肺功能。研究指出，中藥及其活性成分通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)保護(hù)肺功能[8]。肺功能檢測(cè)是評(píng)估COPD病情嚴(yán)重程度、預(yù)后及評(píng)定療效的重要方法[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，藏紅花素處理后大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC顯著升高，且與藏紅花素劑量呈正相關(guān)，表明藏紅花素可改善COPD急性加重期大鼠的肺功能。COPD患者及大鼠肺泡上皮細(xì)胞異常凋亡與肺組織病理改變或肺功能改變有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，藏紅花素處理后，COPD急性加重期大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著降低，這與藏紅花素處理后肺功能得到改善相吻合。慢性炎癥是COPD發(fā)病的核心機(jī)制，COPD急性加重期患者血清和肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6等促炎因子水平顯著增加，其與巨噬細(xì)胞活化和中性粒細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)有關(guān)[12]。已有報(bào)道顯示，西紅花苷可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型大鼠的炎癥反應(yīng)和肺血管功能障礙[13]。同時(shí)，藏紅花素可通過(guò)改善抗氧化防御，減少促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β產(chǎn)生，抑制甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝毒性反應(yīng)[14]。本研究中，藏紅花素以劑量依賴方式抑制大鼠血清中促炎因子IL-1β、脂質(zhì)過(guò)氧化副產(chǎn)物MDA水平以及細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH水平，表明藏紅花素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)進(jìn)而改善COPD急性加重期大鼠肺功能。

NLRP3是一種細(xì)胞內(nèi)受體，其通過(guò)與PAMP等結(jié)合激活Caspase-1誘導(dǎo)促炎因子IL-1β和IL-18活化和釋放，介導(dǎo)宿主促炎反應(yīng)，參與COPD等呼吸系統(tǒng)疾病進(jìn)展[15]。研究表明，COPD動(dòng)物模型肺組織NLRP3表達(dá)水平與肺功能損傷程度相關(guān)[16]。COPD患者血清IL-1β水平升高，且其表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。氧化應(yīng)激可介導(dǎo)NLRP3炎性小體活化促進(jìn)COPD進(jìn)展[18]。藏紅花素通過(guò)抑制NLRP3信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的焦慮和抑郁樣行為，改善大鼠糖尿病腎病相關(guān)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[19-20]。本研究中藏紅花素處理后，大鼠肺組織NLRP3水平顯著降低，血清IL-1β水平降低，表明藏紅花素可能通過(guò)下調(diào)NLRP3表達(dá)改善COPD患者肺功能。

綜上所述，藏紅花素通過(guò)下調(diào)NLRP3表達(dá)改善COPD急性加重期大鼠的肺功能，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡。