海龍黃精散對微波輻射誘導少弱精子癥小鼠受損生精細胞的作用研究

陳天帷，李志剛，王 彬，畢煥洲，李海松，于珊珊，葉雯佳

(1.北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518172)

不育癥是指育齡男女同居1年未避孕，有正常性生活而未孕[1]。少弱精子癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一[2-3]。長期電磁輻射環(huán)境的暴露被認為是精子質量下降的原因之一[4]?，F代醫(yī)學針對少弱精子癥尚無特效藥，治療藥物主要以他莫昔芬、氯米芬、胰激肽原酶、左卡尼汀、維生素E為主[5]。畢煥洲等[6]通過長期臨床實踐發(fā)現，海龍、黃精兩味中藥按照1∶1比例組成海龍黃精散，治療微波輻射引起的男性不育癥有顯著療效。研究表明，炎癥反應可上調精漿白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平，且與精子數量減少、進行性精子活動能力下降有關[7]。本實驗以微波輻射誘導少弱精子小鼠為模型，以TNF-α、IL-6、白介素-12(IL-12)為觀察指標，探討海龍黃精散干預少弱精子癥的作用機制，為海龍黃精散治療少弱精子癥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組：選用SPF級7周齡BALB/c雄性小鼠40只，動物購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2018-002。將小鼠飼養(yǎng)于深圳市耳鼻咽喉研究所實驗室，室溫(24±1)℃，濕度(50±5)%，12 h明暗交替，適應性喂養(yǎng)1周。遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》[8]進行實驗操作。

1.1.2 實驗藥物：海龍、黃精由北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院中藥房提供。

1.1.3 實驗儀器與試劑：微波治療儀(KJ-6200B型，徐州市萬諾醫(yī)療設備有限公司)，微波泄露檢測儀(HI-1501型，美國ETSLindgren公司)，生物倒置顯微鏡(BX43型，日本Olympus公司)，數字病理切片掃描儀(VS200型，日本Olympus)，多功能酶標儀(SpectraMax M3型，美國Molecular Devices公司)。TNF-α ELISA kit(批號 KGEMC102a，凱基生物)，IL-1 ELISA kit(批號 EK1176)，IL-6 ELISA kit(批號 EK1222)，IL-12 ELISA kit(批號 EK14746)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組與給藥：將40只小鼠采用隨機數字表法進行分組，分為空白組、模型組及海龍黃精散小、中、大劑量組，每組8只，除空白組外，其余四組進行微波輻射造模。參照文獻[9]建立微波輻射不育癥模型，將小鼠置于透明亞克力缸中，暴露在頻率為2450 MHz連續(xù)微波，功率密度為40 mW/cm2，輻射18 d，每天1 h。模型組：造模同時灌胃0.9%氯化鈉溶液0.1 ml?？瞻捉M：置于微波燈下但未予輻射，灌胃0.9%氯化鈉溶液0.1 ml。海龍黃精散給藥劑量：小鼠按生藥0.6 g/kg劑量每日灌胃1次，每次灌食藥液0.1 ml。8周齡BALB/c雄性小鼠體重約25 g，經計算海龍黃精散劑量應為0.015 g，與0.1 ml的0.9%氯化鈉溶液混勻后灌胃。海龍黃精散小劑量組(0.3 g/kg)：造模同時灌胃小劑量海龍黃精散藥液0.1 ml；海龍黃精散中劑量組(0.6 g/kg)：造模同時灌胃中劑量海龍黃精散藥液0.1 ml；海龍黃精散大劑量組(1.2 g/kg)：造模同時灌胃大劑量海龍黃精散藥液0.1 ml。五組小鼠均連續(xù)灌胃18 d，1次/d。

1.2.2 小鼠精子參數比較：用頸椎脫臼法處死小鼠，立即將各組小鼠兩側附睪和附睪管剖開，用0.1 ml的0.9%氯化鈉溶液沖洗后，滴液于精子計數板Makler上，檢測精子濃度；應用計算機輔助分析檢測精子活力，包括前向運動精子(PR)、非前向運動精子(NP)，精子總活力=PR+NP。

1.2.3 小鼠睪丸組織病理學形態(tài)觀察及Johnson評分評估：取小鼠雙側睪丸，右側置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，將睪丸切成厚度為4 μm的石蠟切片，蘇木-伊紅(HE)染色后鏡下觀察生精小管內生精細胞(精原細胞、精母細胞、精子細胞、精子)、支持細胞損傷情況。并采用Johnson評分法[10]評價精子發(fā)生障礙程度：生精功能正常為10分；各期生精細胞存在，但排列紊亂為9分；生精小管中有少量精子(5～10個)為8分；無精子，但有許多精子細胞為7分；無精子，僅有少量精子細胞(5～10個)為6分；無精子細胞，但有許多精母細胞5分；無精子，僅有個別精母細胞(<5個)為4分；僅有精原細胞為3分；無生精細胞，僅有支持細胞為2分；管腔內無細胞為1分。評分越高，精子發(fā)生越好，反之精子發(fā)生障礙程度越嚴重。

1.2.4 小鼠睪丸組織IL-6、IL-12、TNF-α水平檢測：濾紙吸干左側睪丸組織水分，用電子天平稱重后剪碎，按1∶99添加0.9%氯化鈉溶液，超聲粉碎制備1%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法分別檢測組織IL-6、IL-12、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 各組小鼠精液參數比較 見表1。干預后，模型組小鼠精液PR、NP、精子總活力均較空白組降低(P<0.05)，海龍黃精散小劑量組小鼠NP較模型組升高(P<0.05)，海龍黃精散中、大劑量組小鼠PR、NP、精子總活力均較模型組升高(P<0.05)。

表1 各組小鼠精液參數比較(%)

2.2 各組小鼠睪丸生精小管組織病理學觀察 空白組小鼠生精小管厚度適中，細胞排列較整齊，管腔無明顯增大，可見各級生精細胞和精子，支持細胞排列整齊。模型組小鼠生精小管變薄，細胞排列松散，管腔增大，生精細胞和精子數量減少，甚至各級生精細胞大部分消失，支持細胞部分缺失。海龍黃精散小劑量組小鼠生精小管變薄，細胞排列松散，管腔增大，生精細胞和精子數量減少，支持細胞少部分缺失，較模型組稍改善。海龍黃精散中劑量組小鼠生精小管變薄，細胞排列松散，管腔稍增大，生精細胞和精子數量減少，支持細胞排列尚整齊。海龍黃精散大劑量組小鼠生精小管變薄好轉，細胞排列稍松散，支持細胞排列尚整齊，管腔無明顯增大，生精細胞和精子數量稍減少(圖1)。

圖1 各組小鼠睪丸生精小管組織病理學形態(tài)(HE染色，×400)

2.3 各組小鼠生精小管Johnson評分比較 見表2。與空白組比較，模型組小鼠Johnson評分下降(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散小、中、大劑量組小鼠Johnson評分均升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠生精小管Johnson評分比較(分)

2.4 各組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平比較 見表3。與空白組比較，模型組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平升高(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散小、中、大劑量組小鼠TNF-α、IL-12水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散中、大劑量組小鼠IL-6水平降低(P<0.05)。

表3 各組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平比較(pg/ml)

3 討 論

少弱精子癥屬中醫(yī)學“無子”“艱嗣”“精冷”“精少”等范疇[11]?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸澳凶佣四I氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”，認為腎中精氣與男子生殖功能密切相關，若是精虧氣少則難以有子。調查發(fā)現，少弱精子是近年來男性不育癥較為常見的病因之一[12]。其中腎虛精虧證是少弱精子癥最常見的中醫(yī)證型[13]。睪丸是微波輻射的靶器官之一，微波輻射可以造成睪丸損傷[14]。本研究使用頻率為2450 MHz的連續(xù)微波，功率密度為40 mW/cm2，建立少弱精子癥小鼠模型，探討海龍黃精散對少弱精子癥的作用機制。

中醫(yī)認為腎藏精，主生殖。腎主封藏，具有攝納、貯存、閉藏精氣的功能[15]。腎中所藏精氣之來源，一是稟受于父母的生殖之精，二是從食物中攝取的營養(yǎng)成分和臟腑生理活動過程中化生的精微物質。腎為藏精之本，精氣藏于腎，促進腎中精氣的不斷充盈，防止精氣無故流失，為精氣在體內充分發(fā)揮其生理功能創(chuàng)造必要條件[16]。腎精不足可由先天稟賦不足或五勞七傷等引起，腎精虧虛、命門火衰，亦可因后天脾胃虛寒，化源不足，致腎精不充。海龍黃精散由海龍和黃精兩味中藥組成。海龍，入腎、肝兩經，補腎壯陽，補先天之精；黃精，入肺、脾、腎經，補氣養(yǎng)陰，健脾潤肺、益腎氣，先后天同補。兩藥同用，陰陽調和，以后天之精補先天之精，共同發(fā)揮補腎填精的功效，治療男性不育效果顯著。

高雅靜等[17]研究發(fā)現，高功率微波輻射可致大鼠精子總量、密度和活動率均下降，補腎生精中藥干預后，以上指標得到改善。本研究顯示，微波輻射后小鼠生精小管結構受到不同程度的破壞，生精小管變薄，細胞排列松散，管腔增大，生精細胞和精子數量減少，甚至出現各級生精細胞大部分消失，Sertoli細胞部分缺失。海龍黃精散干預后，生精小管細胞得到改善，精子活率提升。提示微波輻射可能損害小鼠精子發(fā)生睪丸微環(huán)境中的Sertoli細胞，海龍黃精散可逆轉微波輻射對小鼠生精細胞的損害。

本研究發(fā)現，模型組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6和IL-12水平均高于空白組，中、大劑量海龍黃精散組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6和IL-12水平均低于模型組，提示微波輻射可增加小鼠睪丸組織促炎細胞因子的表達，海龍黃精散可抑制微波輻射引起的炎癥反應。細胞因子是具有介導炎癥反應和免疫應答功能的機體蛋白質活性產物，作用于睪丸的生精微環(huán)境，對精子的產生、成熟、獲能、運動等方面有著重要的生理作用[18]。TLR是“模式識別受體”，可以識別高度保守的病原體相關分子模式[19]。TLR配體的激活可以觸發(fā)一個共同的信號通路，從而上調IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α等炎癥因子的表達。睪丸內曲細精管的Sertoli細胞是生精微環(huán)境的重要組成部分，能為精子生成的提供免疫網絡，維持生精功能的正常運行[20]。Wu等[21]研究表明，微波輻射誘導Sertoli細胞中TLRs信號通路的激活，上調細胞因子IL-6、IL-12和TNF-α表達，進而影響精子形成，本研究結果與其一致。Jin等[22]實驗表明小鼠精子質量的下降可能是由于二噁英通過Klotho/PDLIM2/p65途徑影響支持細胞中促炎細胞因子和IL-12分泌，從而促進睪丸炎癥反應，影響睪丸微環(huán)境并誘導生殖細胞凋亡。

綜上所述，海龍黃精散可以提高少弱精子癥小鼠精液質量，升高Johnson評分，降低睪丸TNF-α、IL-6、IL-12水平。本研究為海龍黃精散治療男性少弱精子癥提供了理論基礎。