低強度微波對急性脊髓損傷大鼠體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)電位的影響

謝財忠 戴加飛 湯江帆 劉蓓蓓 丁志清

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1 康復(fù)醫(yī)學(xué)科 2 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇省南京市 210002

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種高致殘性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。脊髓損傷后常出現(xiàn)肢體癱瘓、感覺障礙及大小便功能障礙等[1]，給患者、家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。目前脊髓損傷臨床治療進(jìn)展甚微，治療方案還停留在早期大劑量注射類固醇激素和脊柱手術(shù)減輕脊髓繼發(fā)性損傷以及康復(fù)訓(xùn)練提高患者生活自理能力，而對促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)還沒有有效的方法[2]。微波是臨床常用的物理治療手段，具有改善血液循環(huán)，加快炎癥吸收，促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)作用，已被廣泛用于治療多種疾病[3]。根據(jù)波長不同微波可分為分米波、厘米波和毫米波。臨床上，微波療法的波長多為厘米波。近年來有研究報道毫米波能促進(jìn)脊髓損傷大鼠癱瘓肢體的功能恢復(fù)[4]。但是，有關(guān)微波對SCI修復(fù)的研究不多。本實驗應(yīng)用改良Allen’s法建立大鼠脊髓損傷模型，觀察低強度微波對急性脊髓損傷大鼠體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)電位的影響，探討低強度微波對脊髓損傷修復(fù)的應(yīng)用價值，為臨床上應(yīng)用微波治療脊髓損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 10周齡SPF級雌性SD大鼠72只，體質(zhì)量(220±20)g，由上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科動物房，室內(nèi)環(huán)境為室溫(22±2)℃、相對濕度50%～60%、通風(fēng)良好、自然晝夜規(guī)律，自由攝食和飲水。大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為3組：Sham組、SCI組和MW組，每組24只。每組觀察時相點為術(shù)后1d、7d、14d及21d，每時相點6只動物。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷模型制備：參照文獻(xiàn)[5]所述改良Allen’s法制備脊髓損傷模型。具體方法如下：10%水合氯醛(0.3ml/100g)對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺面上，脊柱中下段正中備皮，碘伏消毒，鋪洞巾。取T10后正中切口，自T10棘突向兩端縱行切開皮膚、肌肉、筋膜等軟組織，切口遠(yuǎn)端至T12脊柱節(jié)段，近端至T8脊柱節(jié)段，用小型咬骨鉗咬除各節(jié)段棘突和椎板，顯露亮白色的脊髓背側(cè)硬膜。利用NYU脊椎沖擊損傷儀，采用改良Allen’s撞擊法打擊T10脊髓，致傷能量為10g×25mm。打擊后出現(xiàn)鼠尾痙攣性擺動、軀體回縮樣撲動及雙下肢弛緩性癱瘓，表明造模成功。術(shù)后沖洗傷口，常規(guī)消毒，用4-0的絲線逐層縫合肌肉皮膚，醫(yī)用紗布包扎切口。術(shù)后3d青霉素G 20萬單位肌肉注射，以預(yù)防感染。每日按摩腹部協(xié)助排尿2次，至形成反射性排尿為止。SCI組和MW組大鼠均成功制備脊髓損傷模型，無死亡。Sham 組大鼠僅行椎板切除術(shù)顯露硬脊膜，無打擊操作。

1.2.2 微波照射治療：MW組大鼠造模后24h開始進(jìn)行損傷部位低強度微波照射治療。采用南京產(chǎn)MTC-3-500型微波治療儀，該微波的波長12.5cm、頻率2 450MHz，輻射器直徑10cm，大鼠仰臥固定于自制裝置，輻射器垂直置于傷口上方與皮膚間隔1拳(8cm)，設(shè)置輸出方式為連續(xù)輸出，照射強度為10W，10min/次，1次/d，5次/周，連續(xù)照射3周。SCI組和Sham組不給予微波照射治療。

1.2.3 運動功能評定：采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分法對所有大鼠進(jìn)行運動功能評定[6]。該法評分范圍為0～21分，0分表示后肢完全無活動，21分表示后肢活動完全正常，評分越高表示運動功能越好。評定時先將大鼠排空尿液，然后放置于開闊地面上，觀察其后肢的關(guān)節(jié)活動、負(fù)重、爬行及軀干平衡能力。本評分于術(shù)前及術(shù)后1d、7d、14d及21d進(jìn)行，每次由2名熟悉BBB評分操作的實驗人員完成，取平均值。

1.2.4 體感誘發(fā)電位(SEPs)檢測：各組大鼠于BBB評分完成后分別進(jìn)行SEPs檢測[7]。SEPs檢測采用Key-point 肌電圖/誘發(fā)電位儀。大鼠麻醉后，依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)的10/20系統(tǒng)將記錄電極置于大鼠頭皮CZ處(即以鼻根至枕骨粗隆的連線為中線再做兩外耳孔的連線)，參考電極置于鼻根皮下，刺激電極置于鼠一側(cè)踝部內(nèi)后方脛后神經(jīng)處，參考電極置于其臨近跟腱處，5個電極均為針式電極。刺激強度以足趾出現(xiàn)明顯抽動為宜。每次測試至少重復(fù)刺激3次以獲得穩(wěn)定的波形，以P1、N1波的潛伏期和波幅作為觀察指標(biāo)。

1.2.5 運動誘發(fā)電位(MEPs)檢測：各組大鼠于SEPs檢測完成后接著進(jìn)行MEPs檢測[7]。MEPs檢測采用Key-point肌電圖/誘發(fā)電位儀和MagPro型經(jīng)顱磁刺激儀。大鼠麻醉后，將記錄電極置于大鼠一側(cè)后肢腓腸肌或比目魚肌肌腹中部，參考電極置于其肌腱鄰近部位，兩電極之間相距1cm，接地電極置于鼠尾部皮下，3個電極均為針式電極。將C-100型圓形刺激線圈聚焦點置于大鼠頭部Cz處附近，根據(jù)大鼠對刺激的反應(yīng)適當(dāng)調(diào)整線圈位置，以達(dá)最佳刺激效果。刺激強度為最大輸出的40%～60%。每次測試至少重復(fù)刺激3次以獲得穩(wěn)定的復(fù)合肌肉動作電位(CMAP) 波形，記錄其潛伏期和波幅的變化。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分情況 術(shù)前大鼠下肢運動功能BBB評分均為21分。術(shù)后Sham組大鼠BBB評分稍微降低(19～20分)，術(shù)后2～3d恢復(fù)正常。SCI組和 MW組術(shù)后1d 大鼠后肢呈弛緩性癱瘓，爬行動作完全依靠前肢運動完成，BBB評分均為 0～1 分，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著時間延長，SCI組和MW組大鼠BBB 評分均有不同程度增加，但在術(shù)后7d和14d 時兩者變化不明顯(P>0.05)，術(shù)后21d時MW組優(yōu)于SCI組(P<0.01)。說明低強度微波有助于急性脊髓損傷功能恢復(fù)，且微波電磁場對急性脊髓損傷修復(fù)需要一定的時長，短期治療效果可能不明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 各組BBB評分比較

2.2 各時相點大鼠SEPs變化情況 Sham組大鼠術(shù)后能引出正常的波形，波的形態(tài)較好較穩(wěn)定。脊髓損傷后大鼠SEPs波形分化不清，波幅顯著降低、潛伏期顯著延長，隨著時間延長，SEPs波形逐漸呈現(xiàn)改善趨勢，潛伏期逐漸縮短、波幅逐漸增加。MW組與SCI組相比，在術(shù)后7d 時P1、N1潛伏期縮短，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在術(shù)后14d和21d時P1、N1潛伏期明顯縮短(P<0.05)。MW組與SCI組相比在術(shù)后7d時P1、N1波幅增大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在14d和21d時波幅均明顯增大(P<0.05)。說明低強度微波有利于急性脊髓損傷后脊髓上行傳導(dǎo)通路的恢復(fù)，且微波電磁場對急性脊髓損傷修復(fù)需要一定的療程。結(jié)果見圖2～5。

圖2 各組SEPs P1潛伏期比較

圖3 各組SEPs P1波幅比較

圖4 各組SEPs N1潛伏期比較

圖5 各組SEPs N1波幅比較

2.3 各時相點大鼠MEPs變化情況 圖6～7示各組大鼠在不同時相點的MEPs變化情況。Sham組大鼠術(shù)后各時間點都能引出正常的波形，且波形比較穩(wěn)定，波的形態(tài)較好。脊髓損傷后大鼠MEPs波形分化不清甚至波形消失，隨著時間延長，MEPs波形逐漸呈現(xiàn)改善趨勢，潛伏期逐漸縮短、波幅逐漸增加。MW組與SCI組相比，在術(shù)后7d時的潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在術(shù)后14d和21d時的潛伏期明顯縮短(P<0.05)。MW組與SCI組在術(shù)后7d時的波幅差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在術(shù)后14d和21d時的波幅明顯增大(P<0.05)。說明低強度微波有利于急性脊髓損傷后脊髓下行傳導(dǎo)通路的恢復(fù)，且微波電磁場對急性脊髓損傷修復(fù)需要一定的療程。

圖6 各組MEPs潛伏期比較

圖7 各組MEPs波幅比較

3 討論

脊髓損傷是日常生活和工作中常見傷病。既往研究表明，外傷性脊髓損傷的危險因素很多，包括暴力、極限運動、高空墜落和酒后駕車[8]。據(jù)報道，青年人群脊髓損傷發(fā)病率較高，但近年來，老年人群脊髓損傷發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢[9]。脊髓損傷病理生理機制復(fù)雜，主要包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷[10]。原發(fā)性脊髓損傷表現(xiàn)為高能量機械外力直接挫裂和壓迫脊髓組織。繼發(fā)性脊髓損傷表現(xiàn)為原發(fā)性損傷引起的一系列細(xì)胞分子反應(yīng)和病理變化，包括損傷部位缺血缺氧、出血、微循環(huán)障礙、血—脊髓屏障破壞、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化、自由基損傷和興奮性氨基酸毒性等，導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘、軸突變性、細(xì)胞凋亡和壞死，損害脊髓結(jié)構(gòu)和功能[11-12]。醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種方法被用于SCI的治療[13]，如吻合手術(shù)、減壓手術(shù)、藥物治療、康復(fù)治療以及細(xì)胞移植等，這些治療方法雖然能夠不同程度地緩解脊髓損傷的病理變化，但是并不能夠改變患者截癱這個結(jié)局。有效促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生及功能恢復(fù)，成為脊髓損傷實驗研究、臨床治療和康復(fù)的關(guān)鍵。

微波療法是一種定向電磁波輻射療法，已被廣泛應(yīng)用于臨床多科疾病。微波是波長為1mm～1m，頻率為300MHz～300GHz的一種電磁波。根據(jù)波長不同可將微波分為分米波、厘米波和毫米波。分米波的波長0.1～1m，厘米波的波長0.01～<0.1m，毫米波的波長0.001～<0.01m。醫(yī)用微波常為波長12.5cm、頻率2 450MHz。微波電磁場能在體內(nèi)產(chǎn)生一系列物理生理效應(yīng)，包括熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)是指生物體組織內(nèi)的帶電粒子、極性分子或偶極子在微波電磁場作用下作交變直線運動和變力旋轉(zhuǎn)運動，相互急劇摩擦碰撞發(fā)生歐姆損耗、介質(zhì)損耗和諧振損耗產(chǎn)生熱量。微波熱效應(yīng)作用于生物體后將產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)，如使局部血管擴張，血液循環(huán)加快，組織代謝增強，白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活力增強，促進(jìn)病理產(chǎn)物的吸收和消散。微波的非熱效應(yīng)是指除熱效應(yīng)以外的其他效應(yīng)，如電效應(yīng)、磁效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等，在微波電磁場的作用下，生物體內(nèi)的一些分子將會產(chǎn)生變形和振動，使細(xì)胞膜功能受到影響，細(xì)胞膜內(nèi)外液體的電狀況發(fā)生變化，從而改變細(xì)胞代謝或增殖狀態(tài)及離子通道特性，引起生物作用的改變。熱效應(yīng)與非熱效應(yīng)往往同時存在，難以截然分開。大功率微波照射時，熱效應(yīng)是主要的，低功率微波輻射主要引起非熱效應(yīng)。研究表明，小劑量微波熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)能促進(jìn)組織再生，加快滲出物的吸收和消散，控制炎癥，提高機體抗病修復(fù)能力[14]。從本實驗結(jié)果來看，大鼠的行為學(xué)評分可見，經(jīng)低強度微波照射，21d時MW組大鼠BBB評分優(yōu)于SCI組大鼠 (P<0.05)。從電生理學(xué)檢測結(jié)果看，在術(shù)后14d和21d時，SCI組和MW組大鼠的SEPs和MEPs潛伏期和波幅雖均發(fā)生明顯改善(P<0.05)，但MW組大鼠的SEPs、MEPs潛伏期和波幅改善更優(yōu)于SCI組 (P<0.05)。說明低強度微波有助于提高脊髓損傷后運動功能恢復(fù)程度，對亞急性階段脊髓損傷修復(fù)有應(yīng)用價值。其機制可能為，微波產(chǎn)生的高頻震蕩電磁場提供膜脂、膜蛋白的側(cè)向遷移、旋轉(zhuǎn)、伸縮運動和高速擺動等能量，改變脊髓神經(jīng)元及其周圍組織細(xì)胞膜上的某些離子通道或蛋白通道，同時誘發(fā)感應(yīng)電流出現(xiàn)溫?zé)嵝?yīng)和非熱效應(yīng)，使細(xì)胞的新陳代謝加強，組織供氧及營養(yǎng)增強，能加速水腫吸收和消除無菌性炎癥，促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)束功能恢復(fù)。

由于微波屬于高頻電治療范圍，而且微波的能量很高，不同生物體在不同狀態(tài)下對微波電磁場的熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)的生理反應(yīng)不同，臨床中必須選擇恰當(dāng)照射劑量和照射時機，同時還要維持一定的照射療程。在本實驗中，大鼠的BBB評分顯示，MW組大鼠在術(shù)后7d和14d時與SCI組相比變化不明顯(P>0.05)；SEPs和MEPs數(shù)值顯示，MW組與SCI組在術(shù)后7d時神經(jīng)功能變化不明顯(P>0.05)。說明微波電磁場對急性期脊髓損傷修復(fù)效果需要一定的療程，短期治療無法達(dá)到理想治療效果。另外，還可能是因為，本研究中實驗?zāi)Ｐ蜑橹囟燃顾钃p傷，脊髓組織受損嚴(yán)重，脊髓出血、水腫、炎癥、缺血等病理改變很重，急性重度受損脊髓神經(jīng)元細(xì)胞休克時間較長，微波電磁場逆轉(zhuǎn)和修復(fù)嚴(yán)重脊髓損傷急性應(yīng)激和病理改變尚需要一定的時間。

綜上所述，低強度微波有利于促進(jìn)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，微波電磁場對脊髓損傷修復(fù)具有一定的應(yīng)用價值，但必須依據(jù)脊髓損傷病情程度選擇恰當(dāng)照射劑量和照射時機，并要維持一定的照射療程。本研究不足之處，未從基因分子水平進(jìn)行相關(guān)機制研究，今后將加強這一領(lǐng)域的探索。