包頭地區(qū)漢族人群ESR2基因SNP rs4986938多態(tài)性與弱精子癥相關(guān)性研究

李得春 王艷國 吳滌

隨著社會的發(fā)展和生活環(huán)境的變化，不孕不育已經(jīng)成為了重要的公共衛(wèi)生問題，據(jù) WHO 的統(tǒng)計，全球大約有15%的夫婦受此困擾，其中約40%～56%是由男性原因?qū)е碌牟辉胁挥?，并有持續(xù)增長的趨勢[1-5]，其中男性精液質(zhì)量異常屬于主要原因[6]。據(jù)報道約24%的低生育率與弱精子癥直接相關(guān)[7-9]。目前，認為男性低生育率的產(chǎn)生多數(shù)由參與精子發(fā)生過程的相關(guān)基因的突變而導(dǎo)致[10]。研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因多態(tài)性與男性不育相關(guān)，但眾多學者研究結(jié)論尚不完全一致，在伊朗人群[11]和日本人群[12]中rs4986938位點的等位基因頻率差異都沒有統(tǒng)計學意義，在中國臺灣人群[13]中與精液濃度有關(guān)，而在中國河南漢族人群[14]中可能與男性不育的發(fā)生相關(guān)。針對男性弱精子癥情況，本研究通過測定中國內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精男性不育患者ESR2基因rs4986938的多態(tài)性，探討ESR2基因多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

資料與方法

1.一般資料：收集包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2018—2019年202名男性就診者資料，由有經(jīng)驗的流行病學專家設(shè)計統(tǒng)一調(diào)查問卷，由經(jīng)過培訓的調(diào)查員逐一詢問獲得詳細的人口統(tǒng)計資料及出行方式、睡眠時間、吸煙、體育鍛煉時間、工作地點、家裝木地板及板材家具裝修狀況等，其中包括文獻報道對男性生殖有影響的消毒劑[15]等內(nèi)容。

2.研究對象確定：選取2018年1月—2019年3月期間于包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院就診的弱精癥患者標本78例作為弱精組，年齡范圍26～44歲，平均年齡(31.2±4.9)歲。正常精液患者標本124例為對照，年齡23～49歲，平均年齡(30.3±5.2)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。其中至少2次精液常規(guī)分析確定為弱精子癥的入組(參照WHO第5版手冊標準)[16]前向運動精子(PR)+非前向運動精子(NP)< 40% 或 PR< 32%，所有標本均排除生殖道感染、精索靜脈曲張、激素水平異常及系統(tǒng)性疾病等。

3.血樣收集和DNA提?。撼槿§o脈血，置于EDTA抗凝管中，-20℃保存，采用基因組DNA提取試劑盒(天根血液基因組DNA提取試劑盒)提取全血基因組DNA，具體步驟按試劑盒說明書操作。

4. PCR擴增,基因型檢測：PCR擴增引物(rs4986938)(F：5′-GGTCCCAGTGTATGACCTGC-3′，R：5′-AAGGTGGAGGGAAGGATGGT-3′)。PCR反應(yīng)體系中含有2.5 μM上游引物1.0 μL，2.5 μM下游引物1.0 μL，DNA 1 uL，TaKaRa LA Taq 0.5 μL，dNTP mixture 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，加ddH2O至25 uL。PCR反應(yīng)條件為94℃，5 min；94℃，30 sec；60℃，30 sec；72℃，40 sec；循環(huán)35次，最后一次72℃延伸5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。rs4986938位點的PCR產(chǎn)物片段是291 bp。PCR產(chǎn)物送通用生物技術(shù)有限公司采用Sanger雙脫氧測序法進行測序，有三種基因型，即GG、GA、AA。

5.統(tǒng)計學處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以百分比表示計數(shù)資料；各基因型的分布、等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗，并計算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，評估基因突變對該疾病發(fā)生的相對危險度；非正態(tài)計量資料用秩和檢驗；采用Logistic回歸法排除混雜因素，分析ESR2基因型多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

結(jié)果

1.一般特征比較：在202例研究對象中，弱精癥患者78名、正常精液男性體檢者124名。χ2檢驗顯示，兩組在工作地點和吸煙方面差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

弱精組和正常組比較，精子總活力、前向運動力、精子活力、精子濃度、前向運動精子、非前向運動精子、不動精子等指標經(jīng)秩和檢驗有顯著性差異，見表2。

表1 研究對象的一般情況比較 [例(%)]

表2 研究對象的精子情況比較

2. ESR2基因rs4986938位點PCR產(chǎn)物：下圖是ESR2基因rs4986938位點的PCR產(chǎn)物，擴增片段是291 bp，見圖1。

圖1 ESR2 rs4986938 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(擴增產(chǎn)物291 bp)

3. ESR2基因rs4986938位點等位基因及基因型頻率分布：ESR2基因rs4986938位點多態(tài)性有三種基因型，即GG、AG、AA。弱精組ESR2基因rs4986938位點GG基因型頻率為73.1%，低于對照組(87.1%)，差異有統(tǒng)計學意義。弱精組中AA 基因型頻率為5.1%，與對照組(1.6%)無顯著差異。此外，弱精組患者 AG基因型頻率為 21.8%，高于對照組(11.3%)，差異有統(tǒng)計學意義；在弱精組中，ESR2 基因rs4986938的A等位基因頻率為16.0%，高G等位基因頻率為84.0%。A等位基因頻率高于對照組(7.3%)，差異具有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 兩組患者rs4986938位點基因及基因型頻率分布 [例(%)]

弱精癥雜合子基因測序圖灰色區(qū)域代表突變堿基，見圖2。

圖2 ESR2基因rs4986938位點雜合子基因測序圖

4. ESR2基因rs4986938位點多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系分析結(jié)果：在調(diào)整吸煙、工作地方等影響因素后，GA+AA基因型與GG基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義；具有GA和AA基因型者，男性不育的發(fā)病風險降低(OR=0.41,95%CI:0.20～0.86)，結(jié)果見表4。

表4 ESR2基因rs4986938位點多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系 [例(%)]

討論

男性的優(yōu)勢激素為雄激素，但是男性體內(nèi)雌激素的水平會直接影響雄激素的水平，雌激素主要是通過雌激素受體來實現(xiàn)其作用[17]。雌激素受體有兩種，ESR1和ESR2。其中ESR2主要分布在睪丸、前列腺、卵巢、松果體、甲狀腺、淋巴組織、尿道中[18-19]，研究顯示，ESR2是卵泡發(fā)育和精子發(fā)育過程中的雌激素發(fā)揮功能的介導(dǎo)物[20]，所以，ESR2與男性不育相關(guān)研究較多[21-22]。雌激素受體2是由ESR2基因編碼的，ESR2基因定位于14q22-24，全長約40 kb，包括8個外顯子和7個內(nèi)含子，編碼530個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。ESR2基因rs4986938位點位于ESR2基因的第8外顯子的3′非編碼區(qū)第1730號核苷酸，rs4986938位點由G突變?yōu)锳，因其處于非編碼區(qū)，可能會影響ESR2的表達和功能，進而影響雌激素的生理功能[23]。

本文分析了近年中國內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精癥男性不育患者的ESR2基因SNPrs4986938多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)A等位基因頻率顯著高于對照組。本實驗由于AA基因型數(shù)量較少，故將GA基因型與AA基因型數(shù)量合并后進行統(tǒng)計。經(jīng)Logistic回歸分析，GA+AA基因型頻率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義；在調(diào)整有影響的混雜因素后，結(jié)果提示GA+AA基因型與GG基因型比較可以降低包頭地區(qū)弱精癥男性的不育風險，這與其他學者的相關(guān)研究有一定的不同。2010年，有學者[11]發(fā)現(xiàn)伊朗人群此位點的等位基因在對照組與病例組中的頻率差異無統(tǒng)計學意義；2011年中國臺灣學者[13]發(fā)現(xiàn)此位點的多態(tài)性與精液濃度有關(guān)。而本文所得結(jié)果可能與種族、生活的環(huán)境以及生活的方式不同等因素造成。另外，本研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，弱精人群和正常組比較戶外和室內(nèi)的工作地點有差異，可能因長期接受紫外線照射可造成DNA的損傷；其次，這可能與包頭是一座重工業(yè)城市有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)每天吸煙大于20支在弱精組和正常組之間有顯著性差異，這與多數(shù)學者研究相符[24-26]。

本研究提示，ESR2基因SNPrs4986938位點GA+AA基因型可降低弱精癥男性不育風險，ESR2基因rs4986938位點多態(tài)性可能與包頭地區(qū)漢族人群中弱精子癥發(fā)病風險相關(guān)，由于本研究實驗樣本數(shù)量有限，可能導(dǎo)致本研究結(jié)果具有一定的局限性。更多有利于臨床研究的數(shù)據(jù)還需進一步加大樣本量研究并驗證，以闡明ESR2基因多態(tài)性在弱精男性不育中的作用機制，為男性不育提供理論依據(jù)。