宮腔灌注粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)薄型子宮內(nèi)膜解凍移植的影響

梁俊霞 張麗 張玉 田瑛 閆蒙 邵云

子宮內(nèi)膜厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度稱為薄型子宮內(nèi)膜[1]。關(guān)于薄型子宮內(nèi)膜的定義各家報(bào)道不同，目前常用的界定厚度為<7 mm[2]。薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生與炎癥、藥物及醫(yī)源性損傷等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢刺激周期中薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生率高達(dá)38%～66%，體外受精-胚胎移植中薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生率為1%～2.5%[3]。由于薄型子宮內(nèi)膜容易導(dǎo)致妊娠率及胎兒活產(chǎn)率明顯降低，而采取輔助生殖技術(shù)助孕時(shí)，取消移植的概率增加，因此，改善子宮內(nèi)膜厚度成為提高輔助生殖技術(shù)成功率的關(guān)鍵因素之一。人粒細(xì)胞集落刺激因子(Human granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)是由多種細(xì)胞合成的一種特殊細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)[4]，G-CSF參與了女性生殖系統(tǒng)中卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、排卵、子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)、胚胎種植和妊娠維持等諸多方面，對(duì)女性生殖功能的維持和調(diào)控發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。因此,本研究探討宮腔灌注G-CSF對(duì)于薄型子宮內(nèi)膜患者凍融胚胎移植(frozen thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)結(jié)局的影響。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:回顧性分析2018年1月至2019年12月在河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院和河北省生殖醫(yī)院生殖科就診行FET患者的臨床資料，采用宮腔灌注治療的薄型子宮內(nèi)膜患者76例作為研究組，年齡22～40歲，平均年齡(33.2±4.4)歲。選擇同期未采用宮腔灌注治療，且符合納入標(biāo)準(zhǔn)，無剔除標(biāo)準(zhǔn)的44例患者作為對(duì)照組，年齡21～40歲，平均年齡(33.9±4.9)歲。另將研究組患者的上一個(gè)HRT+FET周期(或HRT周期)作為自身對(duì)照組(前周期組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)包括(1)激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)解凍移植周期；(2)年齡≤40歲，體質(zhì)指數(shù)(Body Mass Index，BMI)18.5～28 kg/m2；(3)既往至少一個(gè)HRT/HRT-FET周期，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度<7 mm；(4)尚有1個(gè)以上卵裂期D3天胚胎(其中至少一個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎)冷凍保存。排除標(biāo)準(zhǔn)包括(1)宮腔鏡檢查提示中、重度宮腔粘連；(2)子宮畸形和子宮內(nèi)膜病變；(3)輸卵管積水；(4)生殖器、盆腔急性感染期的患者；(5)對(duì)G-CSF過敏或禁忌癥者。

2.子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方案:月經(jīng)第3天起口服戊酸雌二醇片(商品名：補(bǔ)佳樂,拜耳醫(yī)藥)2 mg,每日3次,月經(jīng)第 12天子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm,血E2值>100 pg/mL時(shí)添加黃體酮注射液(浙江仙居),每日40 mg 肌肉注射3 d后行D3胚胎移植。若內(nèi)膜厚度未達(dá)到上述指標(biāo)，將繼續(xù)口服戊酸雌二醇片至18 d。所有患者均自月經(jīng)干凈起口服阿司匹林腸溶片75 mg/d。移植后戊酸雌二醇繼續(xù)使用,地屈孕酮片(商品名：達(dá)芙通,雅培制藥,荷蘭)10 mg,每日2次,黃體酮陰道緩釋凝膠(8%)(商品名：雪諾酮，默克雪蘭諾，英國(guó))90 mg，每日1次進(jìn)行黃體支持。FET術(shù)后14～16 d，血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)≥20 U/L為生化妊娠，繼續(xù)黃體支持，F(xiàn)ET術(shù)后28～30 d行陰道超聲檢查，觀察到孕囊即為臨床妊娠，孕囊數(shù)即為胚胎種植數(shù)。

3.宮腔灌注操作方法:研究組患者口服戊酸雌二醇(商品名：補(bǔ)佳樂,拜耳醫(yī)藥)第7天，陰道超聲測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)后，行宮腔灌注治療?；颊呷“螂捉厥?，以0.1%碘伏消毒外陰及陰道，鋪無菌孔巾，窺陰器暴露宮頸，無菌生理鹽水棉球擦拭宮頸。將人工授精管和1 mL注射器組合灌注器，抽吸G-CSF 150 μg (國(guó)藥準(zhǔn)字S19991017)0.6 mL，將人工授精管插入宮頸口，緩慢將藥液注入宮腔。灌注后患者墊高臀部臥位30 min。灌注5 d后復(fù)查陰道超聲測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4.陰道超聲測(cè)量方法:由同一位高年資醫(yī)師使用PHILIPS-EPIQ7彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行測(cè)量。3D9-3v陰道探頭頻率5.0 MHz。測(cè)量?jī)?nèi)容包括(1)子宮內(nèi)膜厚度。即子宮的中矢狀平面中測(cè)量子宮內(nèi)膜-子宮肌層連接的2個(gè)界面之間的最大距離[5]。(2)子宮內(nèi)膜形態(tài)。參考Gonen[6]分型分為A型、B型、C型三型。(3)血流分型參考Shokeir[7]，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。記錄兩側(cè)子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(pulsate index，PI) 、阻力指數(shù)(resistance index，RI) 、收縮期峰值流速/舒張末期流速(systolic peak velocity /diastolic velocity，S/D) 值。

5.評(píng)價(jià)指標(biāo):子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)及內(nèi)膜血流，平均PI=(左側(cè)PI+右側(cè)PI)/2，平均RI=(左側(cè)RI+右側(cè)RI)/2,平均S/D=(左側(cè)S/D+右側(cè)S/D)/2，周期取消率、臨床妊娠率、種植率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，種植率=孕囊數(shù)目/移植胚胎總數(shù)×100%。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用IBM-SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.一般情況:三組患者的年齡、BMI、不孕年限和轉(zhuǎn)化日孕酮(P)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 三組患者一般情況比較

2.三組患者的子宮內(nèi)膜厚度、子宮動(dòng)脈血流參數(shù)比較:完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各組子宮內(nèi)膜厚度和RI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；子宮動(dòng)脈PI值和S/D值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步LSD多重檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，研究組灌注后子宮內(nèi)膜厚度明顯厚于灌注前、對(duì)照組和前周期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究組灌注后子宮動(dòng)脈RI值與前周期組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 三組患者子宮內(nèi)膜厚度及子宮動(dòng)脈血流參數(shù)的比較

3.三組患者子宮內(nèi)膜形態(tài)及內(nèi)膜血流情況比較:A型形態(tài)子宮內(nèi)膜占比在各組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。II型血流子宮內(nèi)膜占比在各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

4.三組患者FET結(jié)局的比較:(1)取消率。研究組的周期取消率明顯低于前周期組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但研究組與對(duì)照組的周期取消率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)臨床妊娠率。研究組的妊娠率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究組和前周期組的妊娠率、對(duì)照組和前周期組的妊娠率組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)種植率。研究組與對(duì)照組的種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究組和前周期組的種植率、對(duì)照組和前周期組的種植率組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表3 三組患者子宮內(nèi)膜形態(tài)及內(nèi)膜血流情況比較

表4 三組患者FET結(jié)局的比較

討論

在胚胎種植的過程中，人類子宮內(nèi)膜僅在極短時(shí)間內(nèi)才能允許胚胎的植入，而這段時(shí)間稱為“種植窗”。除胚胎質(zhì)量外，子宮內(nèi)膜容受性也是妊娠成功的關(guān)鍵因素。薄型子宮內(nèi)膜是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低的原因之一。因此，增加薄型子宮內(nèi)膜患者子宮內(nèi)膜厚度，改善內(nèi)膜容受性，是提高輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)成功率的關(guān)鍵。G-CSF是一種糖蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)血管、促進(jìn)血管發(fā)生的作用。G-CSF在哺乳動(dòng)物的成功妊娠中具有重要的作用,其在卵巢顆粒細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、胎盤、子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均有表達(dá),它可能參與了人卵泡顆粒細(xì)胞、胎盤及子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)、發(fā)育[8]。Zhao等[9]在薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射G-CSF，能使大鼠內(nèi)膜明顯增厚，細(xì)胞角蛋白和波形蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，認(rèn)為G-CSF能促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞再生修復(fù)，且早期給予G-CSF內(nèi)膜增殖效果更好。Gleicher等[10]的一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示,在人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)注射日宮腔灌注G-CSF(300μg)，可使患者的平均子宮內(nèi)膜厚度由6.4 mm增加至9.3 mm,并獲得19.1%繼續(xù)妊娠率。因而認(rèn)為宮腔灌注G-CSF對(duì)薄型子宮內(nèi)膜具有促進(jìn)增殖的作用。本研究宮腔灌注的G-CSF藥物劑量為150 ug，研究結(jié)果顯示，研究組灌注后子宮內(nèi)膜厚度明顯高于灌注前、對(duì)照組和前周期組，提示宮腔灌注150 ug的G-CSF也同樣能改善薄型子宮內(nèi)膜的厚度。

目前,子宮內(nèi)膜容受性與子宮動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性研究表明，子宮內(nèi)膜厚度與子宮動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間有相關(guān)關(guān)系[11]。子宮內(nèi)膜血流間接反應(yīng)胚胎種植部位的微環(huán)境。孫瑩璞等[12]通過雙側(cè)子宮血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化評(píng)價(jià)移植前子宮內(nèi)膜容受性的研究結(jié)果顯示，hCG注射日子宮動(dòng)脈PI 和RI 越高,子宮內(nèi)膜越薄。本研究結(jié)果顯示，灌注后II型血流子宮內(nèi)膜占比比灌注前和前周期組高，但研究組灌注后與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；研究組灌注后子宮動(dòng)脈RI與前周期組比較,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但子宮動(dòng)脈PI值和S/D值在研究組灌注后、灌注前、對(duì)照組和前周期組四組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推斷宮腔灌注G-CSF可能通過改善子宮內(nèi)膜血流來增加內(nèi)膜厚度，但尚不能推斷宮腔灌注G-CSF可改善子宮動(dòng)脈相關(guān)參數(shù)。

研究表明[13],在既往卵巢刺激周期或凍胚移植周期出現(xiàn)薄型子宮內(nèi)膜的患者，在再次凍胚移植時(shí)，采用激素替代方案實(shí)施凍胚移植同時(shí)予以多次的宮腔灌注G-CSF可以減少移植的取消率、增加移植內(nèi)膜的厚度并提升胚胎的種植率和妊娠率。本研究顯示，研究組周期取消率明顯低于前周期組，但研究組與對(duì)照組周期取消率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明,對(duì)于既往因薄型內(nèi)膜周期取消移植的患者，宮腔灌注G-CSF可以改善內(nèi)膜厚度，增加移植的機(jī)會(huì)。

一項(xiàng)納入2個(gè)RCT、5個(gè)非RCT和7個(gè)隊(duì)列研究的Meta分析[14]顯示，G-CSF灌注治療可明顯改善子宮內(nèi)膜厚度，提高臨床妊娠率并降低人工周期取消率，但在胚胎種植率方面沒有明顯提高。同時(shí)，該研究將患者的年齡進(jìn)一步分層顯示，年齡 ≤39歲的患者，G-CSF灌注可以改善子宮內(nèi)膜厚度，提高臨床妊娠率和胚胎種植率。本研究納入的研究對(duì)象年齡≤40歲，研究組的妊娠率和種植率均高于對(duì)照組，但研究組和前周期組，對(duì)照組和前周期組的妊娠率、種植率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，宮腔灌注G-CSF可能使一部分薄型子宮內(nèi)膜患者獲益，但并不能使不加選擇的所有患者改善FET結(jié)局。因此，在未來的臨床實(shí)踐和設(shè)計(jì)研究中，需要甄別哪些患者將是是宮腔灌注G-CSF潛在的獲益者，從而確定宮腔灌注G-CSF的適應(yīng)癥，以提高宮腔內(nèi)灌注G-CSF臨床和研究?jī)r(jià)值。

雖然宮腔灌注G-CSF對(duì)改善薄型子宮內(nèi)膜患者FET結(jié)局的研究在學(xué)界方興未艾，但對(duì)于最佳的給藥途徑、給藥時(shí)間、給藥劑量都尚未達(dá)成共識(shí)，導(dǎo)致各個(gè)研究結(jié)論不盡相同。此外，本研究因樣本量較小、未能對(duì)FET流產(chǎn)率、異位妊娠率和子代的健康情況進(jìn)行觀察。

綜上所述，宮腔灌注G-CSF治療可改善薄型子宮內(nèi)膜厚度，降低激素替代FET周期取消率，提高胚胎種植率和妊娠率。