優(yōu)化樣品留取方法可提高囊胚培養(yǎng)液中游離DNA整倍性的檢測效率

黃錦 加加林 黨玉姣 喬杰 劉平

非整倍體胚胎是導(dǎo)致體外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryotransfer,IVF-ET)妊娠率降低、流產(chǎn)率增高的一個(gè)重要因素。臨床上，可以利用胚胎植入前遺傳學(xué)整倍體檢測技術(shù)(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)選擇整倍體的胚胎移植，提高IVF-ET的妊娠結(jié)局[1-2]。但是，PGT技術(shù)需要胚胎活檢，對胚胎是有創(chuàng)操作[3]；而且，由于胚胎存在嵌合的現(xiàn)象，活檢的細(xì)胞只能在一定程度上代表胚胎的結(jié)果[4]。因此，尋求一種無創(chuàng)的、更全面反映胚胎的方法進(jìn)行胚胎整倍體檢測已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究內(nèi)容之一。

胚胎培養(yǎng)液中存在游離DNA(cell free DNA，cf DNA),近年來，越來越引起生殖領(lǐng)域的關(guān)注。已經(jīng)有學(xué)者利用囊胚培養(yǎng)液中cfDNA檢測囊胚的整倍性[5-6]。由于胚胎培養(yǎng)液中游離DNA來源復(fù)雜且含量極少，給檢測的準(zhǔn)確性帶來困難，限制了在臨床上的應(yīng)用。如何采集培養(yǎng)液標(biāo)本，采集何種時(shí)段的培養(yǎng)液標(biāo)本對于胚胎的診斷至關(guān)重要。因此，本研究針對培養(yǎng)液的不同采集方法與整倍性檢測進(jìn)行研究。

對象與方法

一、研究對象

本研究共納入239枚囊胚，所有的胚胎均來源于北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心的PGT-A周期。納入患者的PGT-A指征為女方高齡(>38歲)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗。本研究獲得北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

二、方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常規(guī)用藥及監(jiān)測方案進(jìn)行控制性超排卵，注射hCG后36 h經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用單精子卵母細(xì)胞內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)方式受精。受精后16～18 h觀察受精情況，第三天選擇4細(xì)胞以上、碎片<50%的胚胎(多原核來源胚胎除外)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。

2.PGT-A胚胎活檢與遺傳診斷：胚胎培養(yǎng)至第5～6天，選擇4期以上、滋養(yǎng)層細(xì)胞或者內(nèi)細(xì)胞團(tuán)其中一項(xiàng)評級為B以上的囊胚(Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)[7])進(jìn)行活檢，激光活檢3～5個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞?；顧z的滋養(yǎng)層細(xì)胞采用SNP芯片檢測胚胎的整倍性進(jìn)行遺傳檢測，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活檢后的細(xì)胞采用多重置換擴(kuò)增(multiple dilacement amplification, MDA)方法全基因組擴(kuò)增后，雜交至芯片，掃描后的數(shù)據(jù)采用Illumina Genome Studio軟件分析。活檢后的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍。

3.培養(yǎng)液收集與檢測：胚胎在D3天更換囊胚培養(yǎng)液，并采取單胚胎單獨(dú)培養(yǎng)，收集可以PGT-A活檢囊胚的培養(yǎng)液。收集方法分為三個(gè)階段，即(1)第一階段。胚胎D3天打孔后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液，收集D3～D5/D6的培養(yǎng)液；(2)第二階段。胚胎D3天打孔后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液，D4天再轉(zhuǎn)入另一新的培養(yǎng)液，收集D4-D5/D6的培養(yǎng)液；(3)第三階段。胚胎不做打孔處理，D3天再次用合適內(nèi)徑的剝卵針輕柔地去除顆粒細(xì)胞后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液，D4再轉(zhuǎn)入另一新的培養(yǎng)液，收集D4～D5/D6的培養(yǎng)液。

囊胚活檢后，留取相應(yīng)的培養(yǎng)液滴至PCR管中，-20℃保存。囊胚在活檢前不進(jìn)行皺縮，所有收集的囊胚培養(yǎng)液樣本不含有囊胚皺縮后產(chǎn)生的囊腔液。所有樣本均進(jìn)行無創(chuàng)胚胎染色體整倍性篩查(noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy,NiPGT-A)檢測整倍性,即先將樣本進(jìn)行多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)擴(kuò)增后，采用二代測序(next generation sequencing,NGS)方法檢測整倍性[8]。

4.胚胎移植：PGT-A結(jié)果為整倍性的胚胎可以移植。所有周期均采用解凍單囊胚移植。本研究中共有56枚PGT-A整倍性胚胎移植，分析對應(yīng)胚胎的NiPGT-A結(jié)果，統(tǒng)計(jì)臨床妊娠結(jié)局。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:背靠背獲得囊胚的PGT-A結(jié)果和培養(yǎng)液的NiPGT-A結(jié)果。分析NiPGT-A方法的檢出率、NiPGT-A結(jié)果與PGT-A結(jié)果倍性一致性、整倍體符合率、非整倍體符合率、顆粒細(xì)胞污染率等。

結(jié) 果

239枚囊胚中209枚囊胚有NiPGT-A結(jié)果，NiPGT-A檢出率為87.5%(209/239)。隨著采樣方法的改進(jìn)，NiPGT-A結(jié)果與PGT-A結(jié)果倍性一致性、整倍體符合率逐漸提高，顆粒細(xì)胞污染率逐漸降低。見表1。

表1 不同采樣階段培養(yǎng)液中游離DNA整倍性與囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞整倍性的結(jié)果比對Table 1 Comparison of NiPGT-A and PGT-A results at different sampling phases

239枚胚胎中有56枚PGT-A整倍體的胚胎移植，其中23枚胚胎的結(jié)局為活產(chǎn)/持續(xù)妊娠。NiPGT-A沒有結(jié)果的胚胎妊娠率較高(71.4%，5/7)，高于NiPGT-A為整倍體或者非整倍體胚胎的臨床妊娠結(jié)局(整倍體：33.3%，9/27；非整倍體：40.9%，9/22)。見表2。

表2 移植胚胎的NiPGT-A結(jié)果與妊娠結(jié)局的關(guān)系Table 2 Relationship between NIPGT-A results of embryo transfer and pregnancy outcome

討 論

2013年，分別有學(xué)者在囊胚腔液和胚胎培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)有游離的DNA，可用于預(yù)測胚胎遺傳學(xué)或形態(tài)學(xué)特征[5-6]。由于囊胚腔液極少而且獲取不易，不論是顯微操作法或者囊胚皺縮法均對胚胎是有創(chuàng)操作。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者將研究焦點(diǎn)集中在囊胚培養(yǎng)液中cf DNA。

囊胚培養(yǎng)液的體積很小，大約10～50微升左右，其中的cf DNA含量甚至少于單細(xì)胞DNA的含量，這些都給該領(lǐng)域的研究帶來困難。目前，囊胚培養(yǎng)液cf DNA與對應(yīng)囊胚的整倍體關(guān)系研究頗多[8-10]。2016年，有學(xué)者報(bào)道已經(jīng)利用該技術(shù)分娩健康嬰兒[8]。然而，更多的研究顯示，培養(yǎng)液中cf DNA的整倍性與胚胎的一致性并不穩(wěn)定。Vera-Rodriguez等研究發(fā)現(xiàn)[11]，培養(yǎng)液中cf DNA的整倍性與PGT周期的滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的符合率僅有67%。Capalbo 等的研究提示[12]，在PGT-M周期，囊腔液cf DNA與滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的符合率僅2.9%(2/69),培養(yǎng)液cf DNA與滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的符合率20.8%(15/72)；在PGT-A周期中，cf DNA的擴(kuò)增失敗率較高65.2%，擴(kuò)增成功的樣本與PGT-A符合率為37.5%。因此，在目前的技術(shù)條件下，培養(yǎng)液cf DNA的檢測結(jié)果應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步完善。

囊胚培養(yǎng)液中cf DNA來源與組成成份十分復(fù)雜，這也是目前cf DNA檢測結(jié)果不能廣泛應(yīng)用于臨床的主要原因之一。培養(yǎng)液cf DNA可能來源于囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞，可能來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，也可能來源于卵裂球細(xì)胞，甚至還可能來源于包繞卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞。如果cf DNA中來自于顆粒細(xì)胞的比例過大，就會(huì)導(dǎo)致cf DNA檢測結(jié)果不能反映胚胎的真實(shí)狀況，發(fā)生母源污染引起誤診。許多學(xué)者的研究已經(jīng)注意到母源污染的存在以及對診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的影響[11-12]。因此，囊胚培養(yǎng)液的采集方法對cf DNA檢測結(jié)果至關(guān)重要。對于該技術(shù)的準(zhǔn)確性與否，通常與臨床上廣為應(yīng)用的PGT-A檢測結(jié)果做參考進(jìn)行比較。臨床上PGT囊胚活檢主要有兩大類不同方法，包括D3打孔、囊胚形成疝再行活檢以及D3不打孔、囊胚期活檢前或者活檢同時(shí)再進(jìn)行打孔。因此，本研究針對PGT周期，分別采用了三種不同的囊胚培養(yǎng)液的采集方法，背靠背比較了cf DNA與相應(yīng)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的結(jié)果。在第一階段，胚胎D3天打孔，由于胚胎中含有碎片，打孔后會(huì)有碎片釋放到培養(yǎng)液中；因此，雖然第一階段的cf DNA檢出率較高(94.0%)，但是倍性符合率僅為55.0%。第二階段中，為了減少漏出的胚胎碎片對cf DNA檢測準(zhǔn)確性的影響，胚胎D3天打孔，D4天再轉(zhuǎn)入另一新的培養(yǎng)液，收集D4～D5/D6的培養(yǎng)液；倍體符合率高于第一階段(69.2% vs 55.0%)，特別是非整倍體符合率為100%。第三階段中，胚胎不做打孔處理，D3再次去除顆粒細(xì)胞,D4轉(zhuǎn)入另一新的培養(yǎng)液，收集D4～D5/D6的培養(yǎng)液。cf DNA檢出率為86.0%，倍性符合率為76.7%。隨著采樣方法的逐步優(yōu)化，倍性符合率逐漸增加，污染率也逐漸下降(9.3%、7.7%、2.3%)。本研究發(fā)現(xiàn)，在卵裂期再次去除顆粒細(xì)胞、收集D4到D5/D6的囊胚培養(yǎng)液，是一種較理想的NiPGT-A檢測的采樣方法。

眾所周知，囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞是未來發(fā)育成胎兒的部分，而滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤和胎膜的起源。目前，臨床PGT周期采用的是滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，由于胚胎存在嵌合現(xiàn)象，有時(shí)候PGT結(jié)果并不能反映胚胎真實(shí)的整體狀況。那么，培養(yǎng)液中cf DNA是包含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)層等細(xì)胞釋放的DNA混合體，會(huì)不會(huì)更好地反映胚胎的真實(shí)情況？Huang等[13]針對PGT周期捐贈(zèng)的胚胎進(jìn)行研究，研究人員將胚胎解凍后單獨(dú)培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)液cf DNA、整個(gè)胚胎的整倍性，并且與之前的PGT滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測結(jié)果作比較。Huang等[13]研究結(jié)果提示，cf DNA檢測能更好地代表胚胎整體狀況，檢測的特異性(80.0% vs 50.0%)和整倍體符合率(83.3% vs 62.0%)均優(yōu)于PGT的滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測。但是，也有學(xué)者提出[14]，囊胚期的胚胎具有自我修復(fù)能力，而且培養(yǎng)液中的cf DNA主要是來自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)還是滋養(yǎng)層細(xì)胞尚不清楚。因此，cf DNA檢測是否能更好地反映胚胎狀況還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的結(jié)果，移植的胚胎中，7枚NiPGT-A擴(kuò)增失敗沒有結(jié)果的胚胎，5枚獲得臨床妊娠(71.4%)。這可能是由于胚胎質(zhì)量好，凋亡的細(xì)胞少，培養(yǎng)液中cf DNA含量少的緣故所致。這也提示在臨床應(yīng)用中，NiPGT-A無檢測結(jié)果的胚胎還應(yīng)該慎重評價(jià)。

對于NiPGT-A是否能夠應(yīng)用于臨床，引起了生殖領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前，已經(jīng)有一些學(xué)者開展了臨床研究。Rubio等[15]在4大洲的8個(gè)生殖中心開展了一項(xiàng)分析NiPGT-A與PGT-A結(jié)果一致性的研究，研究的中期(1/3結(jié)點(diǎn))分析結(jié)果顯示，結(jié)果一致性為78.2%(62.1%～85.7%)，且不同的取卵方案、培養(yǎng)條件、胚胎質(zhì)量不影響NiPGT-A結(jié)果的準(zhǔn)確性。

囊胚培養(yǎng)液中的cf DNA雖然含量少，成份來源復(fù)雜，但是能夠提供胚胎的內(nèi)在信息，并且對胚胎是一種無創(chuàng)方法。因此，眾多學(xué)者正在探索其在臨床應(yīng)用的可行性及有效性。本研究通過優(yōu)化采樣方法，提高cf DNA的檢測效率和準(zhǔn)確性，推薦D3天再次去除顆粒細(xì)胞，采集D4～D5/6天囊胚培養(yǎng)液，而且不針對胚胎進(jìn)行打孔處理。本研究提出了采樣方法對Ni-PGT檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要意義，為將來該技術(shù)在臨床應(yīng)用提供可行性參考。