利用基因芯片分析比較Giza75和SG747纖維發(fā)育差異表達(dá)基因

宋吉坤，辛 玥，李龍?jiān)?，劉國元，裴文鋒，馬建江，曲延英，于霽雯，吳 嫚

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/教育部棉花工程研究中心，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】我國棉花每年種植面積約333.33×104hm2(5 000萬畝)，借助檢測海島棉和陸地棉棉纖維發(fā)育過程中基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，闡明關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，有助于解析調(diào)控棉纖維品質(zhì)的分子機(jī)制，對棉花纖維品質(zhì)遺傳改良有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉屬包括46個二倍體棉種(2n= 2x= 26)和5個異源四倍體棉種(2n= 4x= 52)。異源四倍體棉花品種起源于A基因組和D基因組的自然雜交[1]，其中包括兩個商業(yè)上重要的栽培品種陸地棉(GossypiumhirsutumL.)和海島棉(GossypiumbarbadenseL.)。陸地棉適應(yīng)性廣，產(chǎn)量高，占全球棉纖維產(chǎn)量的90%以上，而海島棉纖維品質(zhì)好，占5%～8%。在形態(tài)、生理、抗蟲性、特別是皮棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)等方面存在著顯著的種間差異。嘗試把海島棉的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到陸地棉中，但因種間雜交后代分離嚴(yán)重一直未獲得成功[2]。在利用經(jīng)典的遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)開展了陸海雜交群體纖維品質(zhì)和產(chǎn)量性狀的QTLs定位及候選基因挖掘等研究[3]，但是鑒定出來的有效QTLs較少[4,5]。芯片技術(shù)為基因表達(dá)研究提供了一個大規(guī)模分析基因表達(dá)譜的平臺，可以同時快速有效地分析大量的轉(zhuǎn)錄本。隨著棉花基因組測序的完成，大規(guī)模的棉花組裝分析應(yīng)用于設(shè)計(jì)高通量的基因芯片的研究越來越多，主要應(yīng)用在棉花纖維胚珠或纖維功能基因組的研究[6,7]。以往的基因表達(dá)譜研究主要集中在單一品種或突變體上，以獲得纖維起始和伸長的候選基因，Alabadyet等[8]利用基因芯片技術(shù)對陸地棉和海島棉纖維之間的變化進(jìn)行評估，確定了特定物種和生育期基因轉(zhuǎn)錄水平。Wu等[9]利用Affymetrix公司的棉花基因芯片對棉纖維長度性狀存在顯著差異的兩組回交近交系進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，并結(jié)合qRT-PCR發(fā)現(xiàn)GhACX和GhKIF與纖維發(fā)育存在密切關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前許多與纖維發(fā)育相關(guān)的基因已經(jīng)被鑒定出來[10-12]，但是海島棉和陸地棉之間纖維品質(zhì)差異的生物學(xué)原因還很少被報(bào)道。需研究Giza75和SG747纖維發(fā)育差異表達(dá)基因。【擬解決的關(guān)鍵問題】以SG747(GossypiumhirsutumL.)和Giza75(GossypiumbarbadenseL.)為材料，利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片對其開花后10 d(10 days after anthesis, 10 DPA)的棉纖維進(jìn)行表達(dá)譜分析，為棉纖維發(fā)育關(guān)鍵候選基因的功能驗(yàn)證提供的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

以海島棉Giza75和陸地棉SG747為材料，分別剝?nèi)?、10、15、20和25 DPA棉鈴的纖維以及葉片、花瓣和花蕾，收集后迅速浸入液氮中進(jìn)行速凍，保存在 -80℃冰箱中備用。每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。田間試驗(yàn)地點(diǎn)在河南省安陽縣白璧鎮(zhèn)中棉所試驗(yàn)基地進(jìn)行(36°06’N，114°21’E)，室內(nèi)試驗(yàn)在河南省安陽市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

利用CTAB法提取5、10、15 、20、25 DPA的纖維及葉片、花瓣、花蕾的總RNA[13]。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)分開提取RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性及純度。利用DU800核酸/蛋白質(zhì)分析儀(Beckman Coulter，Brea，CA，USA)檢測RNA的質(zhì)量和濃度。

1.2.2 基因芯片的制備及差異表達(dá)基因的篩選

GeneChip?棉花基因組芯片購自美國Affymetrix公司，基因芯片雜交及分析由上海晶泰生物技術(shù)有限公司完成。分別以Giza75和SG747纖維發(fā)育10 DPA的3個生物學(xué)重復(fù)混合而成的RNA池與GeneChip?棉花基因組芯片雜交，方法同Li和Wu等一致[14,15]。以陸地棉SG747纖維發(fā)育10 DPA的芯片雜交結(jié)果為對照，以海島棉Giza75與陸地棉SG747的Log2Ratio值確定上下調(diào)基因。

1.2.3 差異表達(dá)基因的功能預(yù)測

將篩選獲得的差異表達(dá)基因利用COG數(shù)據(jù)庫(Clusters of orthologous groups)和COGNITOR程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)對其進(jìn)行功能預(yù)測分析[15]。

1.2.4 qRT-PCR分析

利用Prime ScriptII第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA合成cDNA(寶生物工程大連有限公司)。從差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選差異表達(dá)顯著的4個基因，使用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，以看家基因Actin為內(nèi)參對照，利用SYBRGREEN PCR MASTER MIX(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)在Light Cycler480熒光定量PCR儀(Roche公司)對4個差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。上海英駿生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)引物合成，每個樣品qRT-PCR設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。表1

表1 qRT-PCR所用基因及其引物序列Table 1 Gene Primers for quantitative RT-PCR analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

Giza75和SG747的2006-2008年纖維品質(zhì)和產(chǎn)量數(shù)據(jù)引自Yu等[13]。利用SAS軟件對Giza75和SG747的纖維長度、強(qiáng)度、馬克隆值、伸長率、整齊度指數(shù)、籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量、衣分和鈴重進(jìn)行Duncan Grouping顯著性分析，檢驗(yàn)各性狀種間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉和海島棉纖維品質(zhì)與產(chǎn)量性狀比較

研究表明，除伸長率以外，陸地棉SG747和海島棉Giza75的纖維長度、馬克隆值、斷裂比強(qiáng)度、整齊度指數(shù)、籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量、衣分和鈴重存在顯著性差異。海島棉Giza75的纖維長度為34.09 mm，纖維強(qiáng)度高達(dá)40.39 mm，馬克隆值為4.57，而其鈴重為3.62 g，衣分為36.92%，籽棉產(chǎn)量為70.95 kg/667m2，皮棉產(chǎn)量為26.68 kg/667m2。海島棉和陸地棉之間可能存在著基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異。表2

表2 陸地棉與海島棉的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量性狀差異Table 2 Fiber quality andyield difference between G. hirsutum and G. barbadense

2.2 差異表達(dá)基因分析及功能預(yù)測

研究表明，棉花基因組芯片共有24 029個探針組成，其中Giza75有12 837個探針信號檢測到(53%)，SG747有13 387個探針信號檢測到(56%)。篩選到3 095個差異表達(dá)基因，其中在1 680個基因在Giza75中高表達(dá)，而1 415個基因在Giza75中低表達(dá)。

2個材料3 095個差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，共分為15類。其中功能預(yù)測基因占比17.80%，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因占比16.82%，翻譯后修飾占比14.32%。根據(jù)P< 0.05、Log2Ratio > 1、 Log2Ratio < -1和基因注釋挑選了20個可能在纖維發(fā)育過程中起到重要作用的基因，其中上調(diào)表達(dá)基因10個，下調(diào)表達(dá)基因10個。圖1，圖2

圖1 差異表達(dá)基因功能分類Fig.1 Distribution of differentially expressed genes based on gene ontology functional classifications

圖2 纖維發(fā)育10 DPA的差異表達(dá)基因Fig. 2 Differentially expressed genes for fiber development 10 DPA

2.3 差異表達(dá)基因的實(shí)時熒光定量PCR分析

研究表明，Gra.2198.1.A1_at在Giza75的纖維發(fā)育關(guān)鍵時期(5、10、15 、20 DPA)和花中的表達(dá)量均超過SG747，而SG747在葉和蕾中表達(dá)量最高。Gra.2198.1.A1_at是一個纖維特異性基因。Gra.85.1.S1_at在Giza75和SG747的纖維發(fā)育不同階段和不同組織中也存在差異表達(dá)。Gra.85.1.S1_at在Giza75的蕾中的表達(dá)量最高；而在SG747的葉片中表達(dá)量最高。Gra.85.1.S1_at在Giza75中10、15和20 DPA時表達(dá)量較低；在SG747中，Gra.85.1.S1_at的表達(dá)從5 DPA開始下降，在15 DPA時表達(dá)量最低，之后表達(dá)量一直升高到25 DPA。Ghi.249.1.A1_at在Giza75和SG747中表現(xiàn)出相同的表達(dá)模式：在花中表達(dá)最高，在纖維中幾乎沒有表達(dá)。在10 DPA時，Ghi.249.1.A1_at在SG747中表達(dá)量高于Giza75，這與基因芯片得到的結(jié)果一致。Ghi.8448.1.S1_x_at在花中的表達(dá)量最高，而在纖維中10 DPA的表達(dá)量最高且在兩個材料中存在顯著性差異，表明該基因也是一個纖維特異基因。圖3，圖4

A:Gra.2198.1.A1_at B: Gra.85.1.S1_at

C: Ghi.249.1.A1_at D: Ghi.8448.1.S1_x_at.

A:Gra.2198.1.A1_at B: Gra.85.1.S1_at;

C: Ghi.249.1.A1_at D: Ghi.8448.1.S1_x_at.

3 討 論

3.1 Giza75和SG747在表型、DNA和基因表達(dá)的差異

海島棉Giza75和陸地棉SG747在產(chǎn)量和纖維品質(zhì)上的差異與以往研究[16-18]的結(jié)果一致，且在兩個材料中的差異達(dá)到顯著水平，這2個材料適合進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。在2580對SSR引物中，有1258對引物檢測到兩種基因型的多態(tài)性，占48.76%。其中EST-SSR多態(tài)性占18.84%[18]。利用基因芯片技術(shù)分析了海島棉與陸地棉基因表達(dá)的差異，共獲得24029條轉(zhuǎn)錄本，其中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本有5757條，在總轉(zhuǎn)錄本中占比23.96%。其中差異表達(dá)倍數(shù)在2倍或2倍以上的轉(zhuǎn)錄本有3095條，在總轉(zhuǎn)錄本中占比12.88%[19]。利用COG數(shù)據(jù)庫將3095條轉(zhuǎn)錄本按照功能分為：其中功能預(yù)測基因占比17.80%，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因占比16.82%，翻譯后修飾占比14.32%。結(jié)果表明，海島棉與陸地棉的基因型差異為48.76%，占差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(23.96%)的2倍。并不是所有的基因型差異都會引起影響基因表達(dá)量的差異。因?yàn)橛行┗虮磉_(dá)差異是由序列差異引起的，也可能會影響基因芯片上的雜交信號[20]。海島棉Giza75和陸地棉SG747在品質(zhì)和產(chǎn)量性狀中都存在顯著差異，是研究DNA水平差異的優(yōu)異材料。

3.2 陸地棉和海島棉之間差異表達(dá)候選基因的功能預(yù)測

根據(jù)P值、Log2 Ratio和基因注釋挑選了20個可能在纖維發(fā)育過程中起到重要作用的基因，結(jié)合前人研究，對4個差異表達(dá)基因Gra.2198.1.A1_at、Gra.85.1.S1_at、Ghi.249.1.A1_at和GhiAffx.25902.1.A1_at進(jìn)行qRT-PCR分析。

Gra.2198.1.A1_at在棉花中編碼一個活化甲基循環(huán)的關(guān)鍵酶，S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。SAHH可以通過影響細(xì)胞分裂素的含量和DNA甲基化水平來調(diào)控基因的表達(dá)和發(fā)育，在抗逆境和抗病毒保護(hù)中發(fā)揮重要作用。然而，SAHH在棉花生長和纖維發(fā)育中的作用仍不清楚[21]。Li等[22]利用cDNA基因芯片在纖維細(xì)胞中檢測到高表達(dá)的SAHH。SAHH通過調(diào)節(jié)，S-腺苷-L-高半胱氨酸/S-腺苷甲硫氨酸(SAH/SAM)比值影響基因的甲基化，調(diào)控基因的表達(dá)，也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素水平影響植物的發(fā)育[19]。在研究中，通過基因芯片篩選到表達(dá)上調(diào)的基因(SAHH)，盡管該基因在海島棉和陸地棉中都有表達(dá)，但表達(dá)水平卻大不相同。在Giza75中，SAHH基因在5 DPA和10 DPA時高表達(dá)；在SG747中的葉片和蕾中高表達(dá)。對于SAHH基因在海島棉Giza75和陸地棉SG747中的作用還需要進(jìn)一步研究。

Gra.85.1.S1_at編碼纖維素合成酶(CesA)的催化亞基。CesA的氨基末端有一個鋅指狀結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)對和特定降解非常重要[23]。在植物組織和細(xì)胞壁發(fā)育階段參與纖維素合成的酶不同[24]，棉花纖維素的生物合成和沉積類型與次生細(xì)胞壁的形成和纖維品質(zhì)密切相關(guān)[25]。最近，Zhang等[26]對4個棉種中的CesAs基因進(jìn)行家族分析，發(fā)現(xiàn)74個纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL附近有18個GhCesA基因。研究發(fā)現(xiàn)Gra.85.1.S1_at的序列片段來源于雷蒙德氏棉，BLAST分析結(jié)果顯示該基因與CesA4具有高度同源性。從其在棉花不同組織和不同纖維發(fā)育階段的表達(dá)來看，CesA4不是一個纖維特異性基因。該基因在海島棉Giza75和陸地棉SG747的葉片和蕾中有較高的表達(dá)；在海島棉Giza75的蕾中表達(dá)量最高，而在陸地棉SG747的葉中表達(dá)量最高。

Ghi.249.1.A1_at編碼一個α-擴(kuò)張蛋白(α-expansin)，與細(xì)胞壁擴(kuò)張和纖維細(xì)胞的伸長密切相關(guān)[27]。α-expansin通過破壞纖維素微絲之間的氫鍵來調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的擴(kuò)張，在棉纖維伸長過程中發(fā)揮作用。Harmer等[27]研究了6個α-expansin基因(GhExp1-GhExp6)。其中，GhExp1和GhExp2為纖維特異性表達(dá)基因。GhExp1可能是纖維細(xì)胞伸長的關(guān)鍵基因。對正常纖維基因型和粗纖維基因型的基因表達(dá)譜的微陣列分析表明，在正常纖維基因型中，α-expansin蛋白表達(dá)與纖維長度呈正相關(guān)，而在粗纖維基因型中不表達(dá)[28]。EST數(shù)據(jù)庫分析表明，4個編碼α-expansin的基因在細(xì)胞伸長期高表達(dá)，但在次生細(xì)胞壁成熟時迅速減少[29]，這些基因在細(xì)胞伸長期起主要作用。Li等[30]通過研究GbEXPATR發(fā)現(xiàn)α-expansin通過對細(xì)胞壁的疏松進(jìn)而在纖維發(fā)育中起關(guān)鍵作用，GbEXPA2在陸地棉中過表達(dá)對成熟纖維長度沒有影響，但產(chǎn)生的纖維壁梢厚，結(jié)晶纖維素含量增加，而在海島棉的過表達(dá)導(dǎo)致纖維更長、更細(xì)、更堅(jiān)固，細(xì)胞壁明顯變薄。研究表明，Ghα-expansin在纖維細(xì)胞中低表達(dá)，而在花中高表達(dá)，不是一個纖維特異性基因，且該基因在陸地棉和海島棉中的表達(dá)趨勢一致。

微管已經(jīng)被證實(shí)與棉花纖維發(fā)育有關(guān)[31]，微管蛋白(tubulin, Tub)是微管的主要結(jié)構(gòu)組成成分，它由α和β2個保守的亞基組成。在棉纖維細(xì)胞中，目前為止已經(jīng)鑒定出9種α-tubulin和7種β-tubulin蛋白[32]。Li等[33]克隆了GhTUB1基因，該基因在纖維發(fā)育快速伸長期8 DPA優(yōu)勢表達(dá)。劉迪秋等[34]通過分析20 DPA棉纖維構(gòu)建的SSH文庫發(fā)現(xiàn)了3個β-tubulins，推測可能特異地調(diào)控棉纖維的纖維素沉積。吳嫚等[16]利用馬克隆值存在顯著差異的2個陸?；亟唤幌挡牧线M(jìn)行高通量基因芯片分析，并結(jié)合qRT-PCR分析推測出β-Tub10正向調(diào)控棉纖維發(fā)育過程，β-Tub1負(fù)向調(diào)控棉纖維發(fā)育過程。研究表明，β-Tub1在花中的表達(dá)量最高，而在纖維中10 DPA的表達(dá)量最高且在陸地棉中表達(dá)量高，表明該基因可能在纖維發(fā)育快速伸長期負(fù)向調(diào)控棉纖維發(fā)育過程。

4 結(jié) 論

分析了海島棉Giza75和陸地棉SG747的基因表達(dá)譜，獲得了3 905個差異表達(dá)基因，并對高倍表達(dá)基因和纖維發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行了定量RT-PCR分析。Gra.2198.1.A1_at正向調(diào)控棉纖維發(fā)育過程，Gra.85.1.S1_at、Ghi.249.1.A1_at和Ghi.8448.1.S1_x_at負(fù)向調(diào)控棉纖維發(fā)育過程。