基于 TMT和PRM 技術(shù)篩選番茄響應(yīng)鹽脅迫差異表達(dá)蛋白

王 強(qiáng)，劉會(huì)芳，韓宏偉，莊紅梅，王柏柯， 王 娟，楊 濤，王 浩，秦 勇

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆蔬菜工程技術(shù)研究中心，烏魯木齊 830091，2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】番茄具有廣泛的適應(yīng)性，但由于土壤或灌溉水含鹽量的增加，番茄的產(chǎn)量減少[1]。土壤鹽漬化已成為世界范圍內(nèi)作物生產(chǎn)的主要威脅之一[2]。栽培番茄總體上被認(rèn)為是中度(約70 mM NaCl)耐鹽，大多數(shù)番茄品種具有耐受輕度至中度鹽脅迫的遺傳潛力[3]。鈉是鹽漬土中的主要離子，從根中吸收并積累在光合組織中，導(dǎo)致離子失衡、細(xì)胞毒性，降低產(chǎn)量。植物具有一系列的耐鹽機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫，包括限制鈉的吸收、增強(qiáng)鈉的排除、調(diào)節(jié)細(xì)胞離子平衡以及在葉片中重新分配鈉[4-6]。鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)失衡、氧化應(yīng)激、光合作用抑制和呼吸系統(tǒng)變化。近年來(lái)隨著蛋白組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)的快速發(fā)展，研究番茄應(yīng)答鹽脅迫過程蛋白質(zhì)變化，為開展番茄響應(yīng)鹽脅迫后的分子機(jī)制研究，在蛋白質(zhì)組學(xué)層面研究番茄耐鹽機(jī)理有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Zhang等[7]報(bào)道鹽脅迫下參與碳水化合物和氨基酸代謝途徑的一些重要基因表達(dá)譜發(fā)生明顯變化。鹽處理對(duì)番茄果實(shí)能量代謝、氧化還原反應(yīng)和成熟過程相關(guān)蛋白的影響[8]。Keutgen和Pawelzik[9]發(fā)現(xiàn)鹽處理提高了草莓的總氨基酸含量，并且鹽處理改變了許多涉及細(xì)胞壁代謝和類黃酮和苯丙酸途徑的關(guān)鍵基因[10]。在番茄中，與蔗糖代謝途徑相關(guān)的酶活性，如酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶活性在鹽處理下都得到了增強(qiáng)[11]。Chen和Plant[12]發(fā)現(xiàn)，在不到4 d的脅迫下，番茄可以瞬時(shí)合成出未確認(rèn)的鹽響應(yīng)蛋白，研究還證明脫落酸在大多數(shù)這些蛋白質(zhì)的合成中并不起主要作用。Amini等[13]鑒定出5個(gè)受24 h鹽脅迫調(diào)節(jié)的番茄蛋白，而chen 等[14]在處理7 d鹽脅迫時(shí)鑒定出23個(gè)鹽脅迫響應(yīng)蛋白，比較了敏感和耐基因型，一些抗氧化蛋白、熱休克蛋白和碳水化合物代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。植物的每個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段(種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng))都表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的敏感性，導(dǎo)致作物生產(chǎn)和產(chǎn)量下降[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析在鑒定與基因型特性相關(guān)的蛋白質(zhì)變化方面非常有效。例如，在鹽脅迫下，鹽生植物鹽芥與甜土植物擬南芥中表達(dá)不同的脅迫蛋白質(zhì)組[17]。對(duì)干旱敏感栽培番茄和耐旱野生番茄(Solanumchilense)根系蛋白質(zhì)組的iTRAQ分析表明，2份材料中的大量蛋白質(zhì)受失水影響[18]。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可以作為選擇耐性性狀的候選標(biāo)記。鹽脅迫是造成番茄產(chǎn)量損失和品質(zhì)嚴(yán)重下降的關(guān)鍵非生物脅迫之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以76 份野生番茄SolanumpennelliiLA716 為供體、栽培番茄M82為受體的漸滲系群體，研究采用 TMT(Tandem Mass Tag)標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合 PRM(Parallel Reaction Monitoring)驗(yàn)證技術(shù)，篩選并驗(yàn)證番茄幼苗在鹽脅迫后的蛋白質(zhì)變化，從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析番茄幼苗在鹽脅迫應(yīng)答過程中的作用，發(fā)現(xiàn)與鹽脅迫相關(guān)的潛在靶標(biāo)蛋白，為深入認(rèn)識(shí)番茄鹽脅迫的耐性分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2019年4月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠試驗(yàn)站日光溫室內(nèi)進(jìn)行，將番茄耐鹽漸滲系IL7-5-5(ST)與番茄鹽敏感M82(SS)的種子播種在草炭、珍珠巖、蛭石(1∶1∶1)基質(zhì)中，按常規(guī)溫室育苗管理。待幼苗長(zhǎng)到4片真葉時(shí)，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛭石清洗干凈，移栽到1/2濃度Hoagland標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行水培，整個(gè)水培系統(tǒng)培養(yǎng)箱大小一致，整個(gè)系統(tǒng)用增氧泵提供氧氣。室內(nèi)環(huán)境控制標(biāo)準(zhǔn)：溫度控制在白天25℃，晚上18℃，空氣濕度40%，光周期為白天14 h/夜晚10 h。每日補(bǔ)充空氣 3 次、每次 30 min，每隔 2 d將蒸發(fā)掉的水分用無(wú)離子水補(bǔ)充到原體積，1 周后開始試驗(yàn)，共設(shè) 2 個(gè)處理：①對(duì)照(CK)：1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；②鹽脅迫處理(S)：在 1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中添加NaCl使其終濃度達(dá)到 200 mmol/L，分別在 0、12 h采樣。每個(gè)處理設(shè)置 3 次重復(fù)，選取待測(cè)材料同一部位葉片，利用液氮速凍后儲(chǔ)藏于-80℃冰箱中待用。

1.2 方 法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取

用液氮研磨樣品，然后將粉末轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，并在裂解緩沖液(包括1%TritonX-100、10 mM二硫蘇糖醇、1%蛋白酶抑制劑雞尾酒和2 mM EDTA)中使用高強(qiáng)度超聲波處理器在冰上超聲3次。加入等量的飽和苯酚(pH值8.0)。然后，將混合物進(jìn)一步渦旋5 min。離心(4°C，10 min，12 000 g)后，將上層苯酚相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。通過添加至少四體積的飽和甲醇硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，并在-20℃下培養(yǎng)至少6 h。在4°C下離心10 min后，丟棄上清液。剩余沉淀物用冷甲醇洗滌，然后用冷丙酮洗滌3次。蛋白質(zhì)在8 M尿素中重新溶解，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 胰蛋白酶消化

將樣品緩慢加入到最終濃度為20% (m/v)的TCA中以沉淀蛋白質(zhì)，然后渦旋混合并在4℃孵育2 h。通過在4℃下以4 500 g離心5 min收集沉淀。用預(yù)冷卻的丙酮洗滌沉淀的蛋白質(zhì)3次并干燥1 min。將蛋白質(zhì)樣品重新溶解在200 mM TEAB中并超聲分散。胰蛋白酶以1∶50胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比加入，用于第1次消化過夜。樣品在37℃用5 mM二硫蘇糖醇還原60 min，并在室溫黑暗中用11 mM碘乙酰胺烷基化45 min。最后，肽通過C18固相萃取柱脫鹽。

1.2.3 TMT標(biāo)記

胰蛋白酶肽首先溶解在0.5 M TEAB中。每個(gè)肽通道用各自的TMT標(biāo)記試劑盒(Thermo Scientific)說(shuō)明書標(biāo)記，并在室溫下孵育2 h。將每個(gè)樣品的5 μL混合，脫鹽并通過質(zhì)譜進(jìn)行分析，以檢查標(biāo)記效率。標(biāo)記效率檢查后，樣品通過加入5%羥胺淬滅。然后將合并的樣品用Strate XC18固相萃取柱脫鹽，并通過真空離心干燥。SS樣本用TMT標(biāo)記126、127和128，而ST樣本用TMT標(biāo)記129、130和131。 進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的生物實(shí)驗(yàn)，技術(shù)重復(fù)3次。

1.2.4 高效液相色譜分離

肽段用高pH反向高效液相色譜分級(jí)，色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm粒徑，4.6 mm 內(nèi)徑，250 mm長(zhǎng))。肽段分級(jí)梯度為8%～32%乙腈、pH10，80 min時(shí)間分離80個(gè)組分，隨后肽段合并為14個(gè)組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)

肽段用液相色譜流動(dòng)相A相(0.1% (v/v) 甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動(dòng)相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置：0～23 min，9%～26%B；23～32 min，26%～38%B；32～36 min，38%～80%B；36～40 min，80%B，流速維持在350 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Q Exactive質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為2.0 kV，肽段母離子及其二級(jí)碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測(cè)和分析。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為400～1 500 m/z，掃描分辨率設(shè)置為70 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍則固定起點(diǎn)為100 m/z，二級(jí)掃描分辨率設(shè)置為17 500。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描(DDA)程序，即在一級(jí)掃描后選擇信號(hào)強(qiáng)度最高的前20肽段母離子依次進(jìn)入HCD碰撞池使用28%的碎裂能量進(jìn)行碎裂，依次進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。自動(dòng)增益控制(AGC)設(shè)置為5E4，信號(hào)閾值設(shè)置為6.3E4 ions/s，最大注入時(shí)間設(shè)置為64 ms，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30 s避免母離子的重復(fù)掃描。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

差異蛋白是以某個(gè)蛋白的log1.5(差異倍數(shù)) > 1 or < -1且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P<0.05 ，即可認(rèn)為是上調(diào)或下調(diào)顯著差異蛋白。利用 GO 對(duì)鑒定差異蛋白進(jìn)行功能分析，蛋白的 GO 注釋信息主要來(lái)源于 UniProt-GOA 數(shù)據(jù)庫(kù)(www. http://www.ebi.ac.uk/GOA/)，采用 hypergeometric 檢測(cè)方法，P<0.05 的GO term 即為統(tǒng)計(jì)上顯著富集的 GO Term。首先, 將蛋白的 ID 轉(zhuǎn)換為 UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)的 ID 然后根據(jù) UniProKB 的 ID 在 UniProt-GOA 中找到對(duì)應(yīng)的 GO 注釋信息。如果有一些鑒定的蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有被注釋到，將使用 InterProScan 同序列比對(duì)的方法去注釋蛋白的 GO 分類。每個(gè)蛋白的分類根據(jù)GO注釋可以分為 3 大類: 生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組成。

1.2.7 PRM 驗(yàn)證

根據(jù) TMT結(jié)果，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)番茄樣品中目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量比較。采用基于質(zhì)譜的PRM技術(shù))對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行靶向定量分析，肽段用液相色譜流動(dòng)相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)和分析。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)非依賴型掃描(DIA)程序。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫(kù)為Solanum_lycopersicum_Uniprot(34 640條序列)，添加了反庫(kù)以計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫(kù)中加入了常見的污染庫(kù)，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響；酶切方式設(shè)置為Trypsin/P；漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2；肽段最小長(zhǎng)度設(shè)置為7個(gè)氨基酸殘基；肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5；First search和Main search的一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度分別設(shè)為20和5 mg/kg，二級(jí)碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da。將半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸的氧化,蛋白N端的乙?；?脫酰胺化(NQ)。定量方法設(shè)置為TMT-6plex，蛋白鑒定、PSM鑒定的FDR都設(shè)置為1%。

PRM肽段參數(shù)：蛋白酶設(shè)置為Trypsin[KR/P]，最大漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為0，肽段長(zhǎng)度設(shè)置為7～25個(gè)氨基酸殘基，設(shè)置半胱氨酸烷基化為固定修飾。Transition參數(shù)：母離子電荷設(shè)置為2、3，子離子電荷設(shè)置為1，離子類型設(shè)置為b、y。碎片離子選擇從第3個(gè)開始到最后1個(gè)，離子匹配的質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為0.02 Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫的差異蛋白表達(dá)模式

研究表明，在ST12 vs ST0 對(duì)比組中，鑒定出 191 種差異共同表達(dá)蛋白，其中有上調(diào)蛋白119種(P≤ 0.05，fold change>1.5)，下調(diào)蛋白 72 種(P≤ 0.05，fold change < 0.67)。在 SS12vsSS0 中，共鑒定到差異表達(dá)蛋白種類為157種，84 種蛋白上調(diào)表達(dá)，73 中蛋白下調(diào)表達(dá)。耐鹽品種中大量蛋白質(zhì)被鹽脅迫激活。鹽處理分別有129和95個(gè)差異蛋白特異于ST和SS。有62個(gè)差異蛋白共表達(dá)，其中 28 個(gè)在 ST和SS中均上調(diào)，15 個(gè)均為下調(diào)，表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的一致響應(yīng)。19個(gè)差異蛋白在差異材料中不同表達(dá)，有5個(gè)蛋白質(zhì)在ST中下調(diào)，在SS中上調(diào)，14個(gè)差異蛋白在ST中上調(diào)，在SS中下調(diào)。在2種材料中，一些蛋白質(zhì)對(duì)鹽處理有相似的反應(yīng)(誘導(dǎo)或抑制)。一些蛋白在SS中被誘導(dǎo)，而在ST中被抑制或沒有改變，反之亦然。2種材料在鹽脅迫下均表現(xiàn)出蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，其中一些變化與2種材料耐鹽基因型特性有關(guān)。圖1

注:(A)差異表達(dá)蛋白(DEPs)比較的數(shù)量。(B)兩個(gè)番茄幼苗DEPs蛋白的維恩圖

2.2 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的GO富集

研究表明，在對(duì)鹽敏感SS和耐鹽ST番茄葉片差異蛋白的 GO 富集分析中，鹽敏感M82在鹽脅迫處理下，差異蛋白主要參與的生物學(xué)過程也是以代謝過程、單組織過程以及細(xì)胞過程最多，分別占顯著差異蛋白的 34%、22%和 24%。刺激響應(yīng)過程、生物調(diào)節(jié)、定位、細(xì)胞成分、細(xì)胞構(gòu)成組織和其他差異蛋白次之，分別占 7%、7%、3%、3%和 2%，細(xì)胞組分條目里，主要富集于細(xì)胞、細(xì)胞器、 分子復(fù)合物和膜分別占34%、27%、17%、20% ; 在分子功能條目里，富集于前 3 位的條目分別是催化活性、綁定和分子功能調(diào)控分別占42%、39%、7%。

主要參與的生物學(xué)過程也是以代謝過程、單組織過程以及細(xì)胞過程最多，占富集到該生物學(xué)過程中差異蛋白的 35%、24%和 23%。刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、定位和其他差異蛋白次之，分別占 6%、6%、4%和 2%，細(xì)胞組分條目里，主要富集于細(xì)胞、細(xì)胞器、分子復(fù)合物和膜，分別占39%、27%、12%、13% ; 在分子功能條目里，富集于前 3 位的條目分別是催化活性、綁定和分子功能調(diào)控，分別占43% 、41%、8%，番茄在鹽脅迫下差異表達(dá)蛋白具有多種分子功能，并參與了多個(gè)生物過程。圖2

注:A、D分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0生物學(xué)過程；圖B、E分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0細(xì)胞成分；圖C、F分別代表SS12 vs SS0、ST12 vs ST0分子功能

2.3 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類

研究表明，耐鹽ST中有121種顯著差異蛋白質(zhì)獲得注釋，分為21種KOG功能，分別用A～Z表示。功能聚類主要有[R]一般功能預(yù)測(cè)、[E]氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，[J]翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，[G]碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，[I]脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，[Q]次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)與分解代謝，[C]能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化， [O]翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶。分別包含17、15、11、10、9、9、9、8種差異蛋白質(zhì)。這表明耐鹽ST幼苗在鹽脅迫下主要影響了的R、E、J、I、Q、C的功能。

感鹽SS中有97種顯著差異蛋白質(zhì)獲得注釋，分為18種KOG功能，分別用A～Z表示。功能聚類主要有 [R]一般功能預(yù)測(cè)，[O]翻譯后修飾，蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)，伴侶蛋白，[J]翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，[Q]次生代謝產(chǎn)物的生物合成，運(yùn)輸和分解代謝，[I]脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝分別包含20、13、10、9、6 種差異蛋白質(zhì)。鹽脅迫下主要影響了感鹽SS的R、O、J、Q、I功能。圖3，圖4

圖3 ST12vsST0響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類Fig.3 KOG functional classification of ST12vsST0 differential proteins in response to salt stress

圖4 SS12vsSS0響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的KOG功能分類Fig.4 KOG functional classification of SS12vsSS0 differential proteins in response to salt stress

2.4 番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白的PRM驗(yàn)證

研究表明，11個(gè)蛋白在 TMT和PRM的定量結(jié)果總體趨勢(shì)在ST、SS中都表現(xiàn)一致性較高，篩選到的差異蛋白質(zhì)可能是番茄幼苗響應(yīng)鹽脅迫的標(biāo)志蛋白質(zhì)，研究結(jié)果將為番茄幼苗鹽脅迫響應(yīng)蛋白標(biāo)志物的篩選提供參考依據(jù)。表1

表1 PRM 和 TMT 的定量結(jié)果比較Table 1 Comparison of PRM and TMT quantification result

3 討 論

3.1 差異蛋白涉及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成

基因表達(dá)是由轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。在鹽脅迫后番茄幼苗中鑒定出了參與蛋白質(zhì)翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成的蛋白質(zhì)。40S核糖體蛋白S13(K4CYU9)、40S核糖體蛋白S13樣(A0A3Q7GKU3)均在ST中表達(dá)豐度上調(diào)，在SS的表達(dá)豐度下降。與PRM蛋白水平變化相一致，說(shuō)明鹽脅迫下耐鹽番茄幼苗核糖體蛋白質(zhì)的上調(diào)可能與轉(zhuǎn)化機(jī)制的總體增強(qiáng)有關(guān)。PRM是靶向質(zhì)譜的最新發(fā)展，比選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)更具特異性和敏感性，并已被廣泛用于定量和檢測(cè)靶蛋白[19-20]。研究結(jié)果表明, 許多種核糖體蛋白除了構(gòu)成核糖體、 參與蛋白質(zhì)生物合成的功能外, 還具有參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、自體翻譯及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等其他功能[ 21-22]。研究結(jié)果顯示，40S核糖體蛋白S26(A0A3Q7FYD2、A0A3Q7GRY8)、40S核糖體蛋白S27(A0A3Q7GX32)都在SS中下調(diào)表達(dá)。說(shuō)明蛋白質(zhì)合成過程中受到鹽脅迫誘導(dǎo)與rRNA結(jié)合的核糖體蛋白的豐度受到影響，進(jìn)而減少感鹽番茄蛋白質(zhì)的合成表達(dá)下調(diào)。

翻譯延伸因子1α是重要的翻譯因子，參與翻譯控制、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞骨架組成、病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)化等重要的細(xì)胞過程。孫偉等[ 23]在鹽脅迫下的鹽地堿蓬獲得的1 000個(gè)表達(dá)序列結(jié)果表明，7個(gè)編碼翻譯延伸因子1的氨基酸序列完全相同，在堿蓬葉子中。延伸因子1-α基因是一個(gè)中等豐富度的基因，其表達(dá)水平表明延伸因子1-α基因可能是鹽誘導(dǎo)基因。研究結(jié)果顯示，延伸因子1-α(A0A3Q7J0Z4)在ST中受鹽脅迫表達(dá)豐度上調(diào)表達(dá)，SS的表達(dá)豐度下降，鹽脅迫誘導(dǎo)了延伸因子1-α蛋白的表達(dá)。

3.2 差異蛋白涉及細(xì)胞過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

當(dāng)植物遭遇鹽脅迫環(huán)境時(shí)，多種鹽響應(yīng)信號(hào)通路被激活以抵抗損害。ABA信號(hào)通路在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，它通過調(diào)控氣孔的關(guān)閉以限制脅迫條件下的水分流失。在研究中，參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的脫落酸脅迫成熟蛋白4(A0A3Q7GZ60)僅在耐鹽IL-7-5-5的葉片中上調(diào)表達(dá)。脫落酸脅迫成熟蛋白是一種小的親水性蛋白，在脫落酸和各種脅迫下會(huì)增加其表達(dá)水平[ 24]。從谷子中提取的一種新基因SIASR1在煙草中的過度表達(dá)顯著提高了對(duì)干旱和氧化脅迫的耐受性，并且SIASR1C可以調(diào)節(jié)一些氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[ 25]。

脫落酸脅迫成熟蛋白(ASR4)在耐鹽IL-7-5-5中增長(zhǎng)2.74倍。有研究顯示番茄也受到鹽脅迫的誘導(dǎo)[ 26]。這些結(jié)果表明，ARS4是番茄耐鹽的重要蛋白，這些防御反應(yīng)是由ABA信號(hào)通路介導(dǎo)的[ 27-28]。其次，與ABA代謝相關(guān)的DEGs或TFs參與了鹽脅迫的響應(yīng)，包括黃色素脫氫酶基因(ABA2)、以及鋅指蛋白WRKY類[29]。 研究顯示黃色素脫氫酶(A0A3Q7G430)與鋅指蛋白GIS2亞型X1在耐鹽IL-7-5-5中上調(diào)表達(dá)，在M82中下調(diào)表達(dá)。因此，與IL-7-5-5表達(dá)水平的增加可能通過誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因影響耐鹽性的增強(qiáng)。

3.3 差異蛋白涉及脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝

脂肪酸生物合成途徑中的乙酰輔酶A羧化酶生物素羧載體蛋白(A0A3Q7I603)、乙酰輔酶A-乙酰轉(zhuǎn)移酶(A0A3Q7FY19)在ST中豐度增加，而在M82中沒有改變。有研究顯示，鹽處理后，乙酰輔酶 a 乙酰轉(zhuǎn)移酶、生物素羧化酶和?；oA合成酶參與了脂肪酸合成的合成,鹽脅迫使玉米幼苗3種蛋白質(zhì)豐度增加[30]。在研究中，參與脂肪酸和核苷三磷酸合成的蛋白在鹽脅迫后ST中的豐度增加。脂肪酸的合成可能參與了番茄對(duì)鹽脅迫的防御反應(yīng)。

胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(LEA)是近年來(lái)備受關(guān)注的一類響應(yīng)逆境脅迫誘導(dǎo)蛋白[31]。脫落酸(ABA)和包括鹽堿在內(nèi)的各種非生物脅迫均可顯著誘導(dǎo)LEA蛋白[32]。LEA蛋白基因AtLEA14的過表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥耐鹽性[33]。此外，在擬南芥中過度表達(dá)狗尾草SiLEA14可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因幼苗對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[34]。在NaCl處理后12 h葉片中，2個(gè)晚期胚發(fā)生豐富蛋白LEA(E1AZA3)在耐受基因型IL-7-5-5/敏感性M82均上調(diào)表達(dá)，但耐鹽型IL-7-5-5蛋白豐度均顯著高于鹽敏感性M82。IbLEA14高表達(dá)愈傷組織中的木質(zhì)素含量比對(duì)照愈傷組織有所增加[35]。推測(cè)較高豐度的LEA蛋白可能參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素的產(chǎn)生，從而提高耐鹽性。

3.4 差異蛋白涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝

氨基酸生物合成和代謝對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)脅迫的反應(yīng)至關(guān)重要[36-39]。蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡在調(diào)節(jié)生物體的細(xì)胞過程以及它們對(duì)發(fā)育或環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫改變了番茄中許多參與氨基酸生物合成和代謝的蛋白質(zhì)物種的豐度，包括精氨酸和脯氨酸代謝；色氨酸代謝；賴氨酸降解；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解。在耐鹽性ST中，已鑒定的蛋白質(zhì)精氨酸酶(A0A3Q7EK65)的豐度因鹽脅迫而增加，其豐度表現(xiàn)出與驗(yàn)證的PRM水平很好的相關(guān)。天冬酰胺合成酶(A0A3Q7GRS5)誘導(dǎo)ST/SS上調(diào)表達(dá)，這與前人有關(guān)天冬酰胺合成酶在耐鹽性和耐寒性中起著關(guān)鍵作用，受到鹽脅迫、滲透脅迫和脫落酸的上調(diào)表達(dá)一致[42-43]。鹽處理也能誘導(dǎo)甲酸脫氫酶(Q5NE18)在耐鹽ST中上調(diào)表達(dá)。這種酶控制著甲酸鹽的體內(nèi)平衡，也被認(rèn)為在AtMKK1(一種應(yīng)激反應(yīng)激酶)調(diào)節(jié)的體內(nèi)起著重要作用[44]。說(shuō)明這些氨基酸的合成可能有利于耐鹽性。

3.5 差異蛋白涉及次生代謝產(chǎn)物的生物合成

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 常被作為緩解植物逆境脅迫生長(zhǎng)過程中的外源物質(zhì)[45-46]。作物在受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)GABA 含量也會(huì)發(fā)生變化，來(lái)調(diào)控代謝從而減少對(duì)作物的傷害。周翔等[47]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 處理玉米幼苗后，根系內(nèi)的 GABA 含量逐漸上升，處理后 36 h 含量最高。鹽脅迫下在耐鹽ST中GABA1(Q84P54)特異顯著上調(diào)了1.6倍，可能與GABA 在植物體內(nèi)的積累，增強(qiáng)植株抗鹽性有關(guān)。在鹽脅迫下，感鹽SS中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧化物氧化酶(P05116)上調(diào)表達(dá)量是ST的2倍。相關(guān)研究表明，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧化物氧化酶基因編碼蛋白能將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(乙烯生物合成的前體)轉(zhuǎn)變成乙烯，乙烯及乙烯的前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸處理能提高水稻和擬南芥的抗鹽性，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸對(duì)高鹽環(huán)境下的野生型擬南芥幼苗能顯著增加抗鹽能力[48]。研究表明，感鹽SS易于受到鹽脅迫的誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生速率較高，進(jìn)而誘發(fā)根部1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)的積累并轉(zhuǎn)移到葉片，加速葉片中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸向乙烯的轉(zhuǎn)化，抵抗鹽脅迫的傷害。而乙烯是一種公認(rèn)的衰老誘導(dǎo)激素，抑制1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶減少滲透脅迫中多胺氧化酶介導(dǎo)的過氧化氫產(chǎn)生[49]，并且多胺氧化酶受乙烯強(qiáng)烈誘導(dǎo)[50]，研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下，在耐鹽ST中多胺氧化酶2(A0A3Q7J1Y7)上調(diào)表達(dá)2.3倍，耐鹽ST在鹽脅迫下，多胺氧化酶的增加，有利于抵抗植物的耐鹽性。

3.6 差異蛋白涉及能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化

由于植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)通常伴隨著許多脅迫反應(yīng)蛋白的誘導(dǎo)，因此，可以預(yù)期其中一些蛋白在耐鹽番茄體內(nèi)的豐度會(huì)發(fā)生特別的變化。為了保護(hù)細(xì)胞免受過多的活性氧(ROS)引起的氧化損傷，植物通常采用一系列復(fù)雜的防御機(jī)制，例如增強(qiáng)抗氧化酶的活性[51]。過氧化物酶(POD)酶參與ROS信號(hào)和氧化還原反應(yīng)，高POD含量可提高植物的耐鹽性[52]。研究表明，耐鹽基因型IL-7-5-5中過氧化物酶(A0A3Q7E8T9)在鹽脅迫下顯著上調(diào)，而在敏感品種中蛋白水平?jīng)]有變化。而過氧化物酶(A0A3Q7ITH0)在鹽脅迫下耐、感材料中都上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫通常提高ROS的產(chǎn)生，通過細(xì)胞膜損傷和對(duì)大分子的攻擊導(dǎo)致植物細(xì)胞氧化損傷。據(jù)報(bào)道，植物耐鹽性與抗氧化酶和抗氧化活性的增加有關(guān)[53-54]。鹽脅迫下高水平的抗氧化酶參與了防止氧化損傷。

3.7 差異蛋白涉及細(xì)胞骨架

植物在鹽脅迫下，滲透脅迫和離子毒性往往會(huì)對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成巨大破壞。在研究中，發(fā)現(xiàn)在ST中微管蛋白相關(guān)蛋白(A0A3Q7F8W6)上調(diào)，而SS中下調(diào)表達(dá)，與PRM驗(yàn)證結(jié)果一致。該蛋白與植物鹽脅迫適應(yīng)相關(guān)，在真核細(xì)胞中構(gòu)建微管骨架結(jié)構(gòu)，控制細(xì)胞擴(kuò)張和細(xì)胞形狀，并與GTP結(jié)合參與翻譯后修飾[55-56]。

4 結(jié) 論

286 種響應(yīng)鹽脅迫差異蛋白(變化倍數(shù)≥1.5，P<0.05) 在ST/SS分別表達(dá)上調(diào)的 119/84 種，表達(dá)下調(diào)的72/73種， 11 種鹽脅迫顯著差異蛋白，以及一些可能作為番茄耐鹽潛在靶標(biāo)蛋白。番茄幼苗組織中代謝過程、細(xì)胞組分以及催化活性響應(yīng)最明顯；PRM 驗(yàn)證結(jié)果和 TMT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體趨勢(shì)一致性較高。