高良姜素對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移和凋亡影響的機制研究

方 超，李婉玉，馮 晨，任春慧，毛藝純，馮 華

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤之一，因其臨床癥狀隱匿，80%患者就診時已處于晚期。傳統(tǒng)的治療卵巢癌藥物以化療為主，包括鉑類和紫杉醇等，但這些藥物副作用較大，容易產(chǎn)生耐藥性。近年來我國傳統(tǒng)中草藥用于卵巢癌的治療一直受到學(xué)者們的關(guān)注，也是我國最富有自主創(chuàng)新特色的研究領(lǐng)域之一[2]。GLA是從我國傳統(tǒng)中藥高良姜中提取的專屬成分，是一種天然的黃酮類化合物[3]。長期以來GLA一直用于治療胃部疾病，近年來有多項研究表明GLA不僅具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、降血脂等作用，而且在多種類型腫瘤中表現(xiàn)出了一定的抗癌活性[4]。細胞凋亡是一種公認(rèn)的腫瘤抑制機制。在凋亡蛋白作用下，細胞凋亡程序可以有效地消除功能失調(diào)的細胞，維持細胞穩(wěn)態(tài)。Bcl-2蛋白家族成員通過調(diào)控促凋亡因子和抗凋亡因子在細胞凋亡的過程中占據(jù)著核心地位。在細胞凋亡過程中，促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2起著截然相反的作用，同樣兩者之間平衡也是決定細胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵所在。Bax會與Bad相互結(jié)合，以復(fù)合體形式來阻止Bcl-2，發(fā)揮促凋亡功能。而Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的創(chuàng)始成員，它能夠中和Bax和Bak，從而防止Bax的過度激活，抑制細胞凋亡。惡性腫瘤的發(fā)展過程一直以來與許多信號傳導(dǎo)通路的異常活化密切相連。有研究表明在細胞受到外來刺激，作出應(yīng)答效應(yīng)過程中PI3K/AKT信號通路發(fā)揮著重要作用[5]。因此以PI3K/AKT信號通路為靶點的腫瘤治療學(xué)一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注熱點之一。本研究以GLA為研究對象，旨在探討GLA是否對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移以及凋亡能力產(chǎn)生影響，其作用機制是否是通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 GLA，相對分子量270.24(MW)，純度>98%，購自上海阿拉丁生物科技有限公司。卵巢癌SKOV3細胞購自武漢procell公司；GAPDH、AKT、p-AKT、Bcl-2、和Bax抗體(萬類生物，沈陽)；CCK8試劑盒(博士德，武漢)；TUNEL細胞凋亡試劑盒(碧云天，武漢)；流式凋亡檢測試劑盒(萬類生物，沈陽)。

1.1.2 儀器設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；熒光正置式生物顯微鏡(日本NiKon公司)；流式細胞儀(美國FACS Calibur公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將卵巢癌SKOV3細胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，細胞每隔2～3 d傳代一次。

1.2.2 CCK8法 以8×103個/孔的細胞密度培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中過夜，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，平行設(shè)置3個重復(fù)孔，用不同濃度梯度GLA(0 μmol/mL、1 μmol/mL、5 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、30μmol/mL、40 μmol/mL、50 μmol/mL、60 μmol/mL、70 μmol/mL、80 μmol/mL)作用于SKOV3細胞，向每孔中加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)1～2 h。根據(jù)測定450 nm的OD值繪制細胞存活率的柱狀圖，細胞存活率(%)=[OD(實驗組)-OD(空白對照組)]/[OD(正常對照組)-OD(空白對照組)]×100%。計算IC50值，IC50=1 g-1[Xm-i(∑p-0.5)]。選取細胞生存率>60%且數(shù)值較高濃度作為GLA給藥濃度，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組 取對數(shù)生長期細胞加入不同濃度GLA組，根據(jù)CCK8結(jié)果分為4個組：對照組，即0 μmol/mL GLA；10 μmol/mL GLA組；20 μmol/mL GLA組；40 μmol/mL GLA組。

1.2.4 細胞劃痕實驗 將SKOV3細胞以5×106個/孔細胞常規(guī)培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)培養(yǎng)的細胞融合達到90%以上時，用200 μL移液器吸頭尖端刮除細胞單層，每孔用PBS溶液沖洗漂浮細胞，分別加入不同濃度(0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL)的GLA，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在倒置光學(xué)顯微鏡下，分別于0 h、24 h、48 h在40倍的放大倍數(shù)下拍照獲得圖片。

1.2.5 TUNEL實驗 將SKOV3細胞接種于6孔板中，加入不同濃度GLA培養(yǎng)細胞24 h，用PBS沖洗，將細胞于4%的多聚甲醛在pH 7.4的NaH2PO4溶液中固定，PBS緩沖液洗滌細胞3次，3% H2O2孵育細胞5 min，在37 ℃避光情況下與TUNEL檢測液混合孵育60 min，將細胞放入終止緩沖液孵育10 min，蒸餾水洗，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)下觀察陽性細胞數(shù)。

1.2.6 流式細胞術(shù) 卵巢癌SKOV3細胞以5×105個/孔分別加入0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL的GLA培養(yǎng)24 h，在膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中孵育細胞制備懸浮液，在室溫避光5 min后，首先添加5 μL的Annexin V-FITC，再次添加10 μL的Propidium Iodide進行染色，用流式細胞儀分析凋亡細胞的百分比，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western Blot法 取卵巢癌SKOV3細胞接種于6 cm2的培養(yǎng)瓶中，孵育過夜后用不同濃度的GLA處理細胞24 h，加入RIPA裂解液(強)，在4 ℃、10000 r/min下離心20 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品加入到12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用5% 脫脂奶粉對膜進行封閉，加入稀釋的一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、p-AKT(1∶500)、AKT(1∶500)以及GAPDH(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日將過夜的一抗回收，加入TBST洗液，洗滌三次，加入按1∶5000稀釋的二抗孵育1 h，然后洗滌，顯影，實驗重復(fù)3次。用Image J軟件計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件，計量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，采用t檢驗和單因素方差分析對不同組別的數(shù)據(jù)進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLA對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響CCK8法結(jié)果顯示，GLA以劑量依賴性方式抑制卵巢癌細胞的生長(圖1)，根據(jù)酶標(biāo)儀測得450 nm的OD值計算GLA對SKOV3細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為49.77 μmol/mL。當(dāng)GLA濃度達到50 μmol/mL時，SKOV3細胞存活率不足60%，故將GLA用藥濃度分別設(shè)定為10 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL。

圖1 不同濃度GLA對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響

2.2 GLA對卵巢癌SKOV3細胞遷移的影響細胞劃痕實驗結(jié)果表明，在劃痕24 h之后，與對照組相比，GLA組的細胞遷移率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在劃痕48 h之后，細胞遷移率顯著減慢，效果比24 h更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性(圖2)。

2.3 GLA對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，GLA組總體的凋亡細胞占比率分別為11.16%(10 μmol/mL組)、14.68%(20 μmol/mL組)和28.5%(40 μmol/mL組)(圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在TUNEL實驗中，TUNEL染色細胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色細胞呈現(xiàn)藍色熒光，以TUNEL陽性細胞數(shù)與DAPI染色細胞總數(shù)之比表示凋亡率。結(jié)果顯示，對照組的細胞凋亡率為6.29%，而GLA組凋亡細胞百分率卻顯著增加，分別是17.79%(10 μmol/mL組)、34.82%(20 μmol/mL組)和44.79%(40 μmol/mL組)(圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為了進一步闡明GLA誘導(dǎo)細胞凋亡的機制，應(yīng)用Western Blot實驗檢測Bcl-2和Bax蛋白表達情況。與對照組相比，GLA組Bcl-2表達降低，而Bax表達升高，呈濃度依賴性(圖5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 GLA對卵巢癌SKOV3細胞遷移的影響

圖3 流式細胞術(shù)檢測GLA對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

圖4 TUNEL檢測GLA對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

圖5 GLA對卵巢癌SKOV3細胞凋亡蛋白的影響

2.4 GLA對卵巢癌SKOV3細胞PI3K/AKT信號通路蛋白的影響應(yīng)用Western Blot實驗檢測PI3K/

圖6 GLA對卵巢癌SKOV3細胞PI3K/AKT信號通路蛋白的影響

AKT信號通路相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，GLA組AKT蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)，而p-AKT蛋白的表達顯著下調(diào)。p-AKT/AKT的比率呈下降趨勢，并且呈濃度依賴性(圖6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌的死亡率一直高居婦科惡性腫瘤之首[6]。傳統(tǒng)的卵巢癌治療方案主要以手術(shù)為主，術(shù)后輔以化療、放療、內(nèi)分泌治療以及免疫治療等[7]，雖然獲得一定的療效，但患者5年生存率并未顯著提高，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性是造成其死亡率居高不下的主要原因。目前臨床上主要缺乏對早期卵巢癌患者特異性診斷方法和行之有效的治療藥物[8]。因此尋找新的抗腫瘤藥物，已成為目前攻克卵巢癌急需解決的關(guān)鍵問題。近年來，我國傳統(tǒng)中草藥在抗腫瘤機制研究史中一直受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥GLA具有良好的抗腫瘤作用[9]。GLA的母核與抗腫瘤活性顯著的細胞周期蛋白激酶抑制劑(Flavopiridol)類似。Flavopiridol是一種廣泛的細胞周期蛋白激酶抑制劑，具有廣泛的抗腫瘤活性[10]，目前已經(jīng)進入了三期臨床試驗。有實驗表明GLA能夠通過促進結(jié)腸癌、肝癌以及乳腺癌細胞中的β連環(huán)蛋白降解來抑制β連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[11]。最新研究顯示GLA能夠抑制肝癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞的增殖[12]，是一種具有良好開發(fā)前景和應(yīng)用價值的天然治療藥物。

PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路活化與多種人類疾病有關(guān)，包括多種癌癥和一些增生性疾病。PI3K/AKT信號通路最初被發(fā)現(xiàn)，是由于它可能會調(diào)節(jié)一定的細胞功能[13]。有研究表明PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、細胞周期進程、血管生成以及凋亡中發(fā)揮著重要作用[14]。有學(xué)者研究表明GLA通過阻斷多種癌細胞的PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路展現(xiàn)了強大的抗腫瘤活性[15]。汪俊劍等[16]研究表明GLA可抑制人肺癌細胞 A549 的增殖和侵襲，是潛在的肺癌治療藥物，其機制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)基因蛋白水平以及抑制 PI3K 和 AKT 磷酸化有關(guān)。劉影等[15]研究探討了GLA誘導(dǎo)人肝癌細胞 SMMC-7721 細胞凋亡時可能通過 PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮作用。但是目前國內(nèi)外文獻報道中關(guān)于在卵巢癌中GLA作用于 PI3K/AKT信號通路的相關(guān)研究則鮮有報道。

本研究通過選取GLA作為研究對象，應(yīng)用不同濃度的GLA作用于卵巢癌SKOV3細胞。CCK8結(jié)果顯示GLA能夠抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖活性，并呈一定的劑量依懶性。根據(jù)其450 nm測定的OD值，計算出IC50值為49.77 μmol/mL。腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移一直是卵巢癌復(fù)發(fā)的主要原因之一，并且發(fā)生了轉(zhuǎn)移癌患者預(yù)后極差。通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過GLA處理后的卵巢癌SKOV3細胞向劃痕區(qū)域移行減慢，其在劃痕24 h和48 h的遷移率明顯低于對照組。實驗結(jié)果證明了GLA能夠顯著抑制卵巢癌SKVO3細胞的遷移能力，呈劑量依懶性。細胞凋亡一直以來與腫瘤細胞的發(fā)展密不可分[16]。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中起著重要作用。Bax和Bcl-2是控制細胞凋亡的主要因素，Bax/Bcl-2活性水平之比是細胞凋亡敏感性的關(guān)鍵因素[17]。本研究應(yīng)用流式細胞術(shù)和TUNEL實驗檢測出GLA能夠誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞的凋亡，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。Western Blot實驗結(jié)果顯示GLA處理的SKOV3細胞Bax蛋白表達量增加，Bcl-2蛋白的表達受到了抑制。PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，一直是眾多學(xué)者研究的重點。在本研究中，GLA組AKT蛋白表達無顯著性差異，而p-AKT蛋白的表達顯著下調(diào)。p-AKT/AKT的比率呈下降趨勢，呈濃度依賴性。結(jié)果表明GLA能夠顯著抑制PI3K/AKT信號通路激活，主要是通過調(diào)控PI3K/AKT蛋白磷酸化來發(fā)揮作用。

本研究尚存在一定局限性，目前只在一個卵巢癌細胞證明了GLA對卵巢癌的抑制作用，但在動物實驗中還沒有深入研究GLA的藥理作用，并且在臨床實驗中GLA的使用效果還有待觀察。大部分黃酮類化合物生物利用度是非常低的，它們在血漿和器官中很難達到抑制腫瘤細胞所需要的每毫升微摩爾數(shù)?？梢栽谖磥淼难芯恐?，GLA聯(lián)合一些納米乳劑和納米脂質(zhì)體，這樣可以保證GLA的最大生物利用度。

綜上所述，GLA可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路來抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細胞的凋亡。通過上述的實驗結(jié)果有力地支持了GLA可以作為一種潛在的治療卵巢癌輔助用藥提供了理論依據(jù)。