KCC2在BDNF抑制酒精依賴大鼠酒精偏好中的作用及機(jī)制

張洪艷，王琦玉，徐璐璐，熊君偉，王 雪，關(guān)艷中

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精使用障礙(Alcohol use disorder，AUD)是一種能引起多種健康后果的慢性復(fù)發(fā)性疾病，酒精作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變以及隨后的認(rèn)知和行為缺陷[1]。VTA與其他大腦區(qū)域如伏隔核(Nucleus accumbens,NAc)和前額葉皮質(zhì)(Prefrontal cortex,PFC)之間的多巴胺(Dopamine,DA)投射系統(tǒng)表明VTA參與了酒精依賴的過(guò)程[2]。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最普遍的生長(zhǎng)因子，在大腦發(fā)育和可塑性中起著至關(guān)重要的作用。BDNF功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種精神障礙性疾病，包括焦慮和藥物濫用[3]。KCC2通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)氯離子穩(wěn)態(tài)，影響γ-氨基丁酸受體(GABAAR)和甘氨酸受體(GlyR)介導(dǎo)的突觸傳遞的有效價(jià)和極性，在中樞神經(jīng)元突觸成熟和功能中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF通過(guò)下調(diào)KCC2影響尼古丁戒斷后的行為變化[5]，VTA注入KCC2激活劑CLP290可以減弱應(yīng)激后大鼠的酒精攝入量[6]?？梢?，KCC2與成癮物質(zhì)有關(guān)。而KCC2是否參與慢性酒精暴露模型中BDNF抑制大鼠酒精偏好作用的研究還未見報(bào)道。本研究通過(guò)向VTA注射KCC2激活劑和抑制劑觀察對(duì)大鼠酒精偏好的影響，并探究BDNF對(duì)酒精依賴大鼠酒精偏好的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重(200±20) g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(黑)2019-006。在有機(jī)通風(fēng)玻璃中單籠飼養(yǎng)，雙瓶飲水一周以適應(yīng)環(huán)境，動(dòng)物環(huán)境溫度為(22±2) ℃，濕度50%～60%，保持晝夜節(jié)律12 h/12 h(即早8∶00到晚20∶00)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SD大鼠保證充足的水和食物，通風(fēng)良好，每周更換墊料，所有動(dòng)物飼養(yǎng)與使用均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》要求執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)方案獲得牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑食用酒精(濃度≥95%)，BDNF(美國(guó)Sigma公司)，CLP290(美國(guó)Tocris Bioscience公司)，VU0240551(美國(guó)Tocris Bioscience公司)，DMSO(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法大鼠主動(dòng)飲酒模型的建立：SPF級(jí)SD大鼠飼養(yǎng)一周后，給予雙瓶飲酒，一瓶20%酒精，一瓶飲用水，24 h后將20%酒精瓶更換為飲水瓶，并記錄24 h的飲酒量(mL)和飲水量(mL)以及體重的變化。再過(guò)24 h，將飲水瓶換成20%酒精瓶，并交換兩瓶位置，以排除位置偏好對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。28 d后大鼠飲酒精攝入量達(dá)到[3.2 g/(kg·24 h)]即為建模成功[7]。對(duì)照組大鼠無(wú)限制自由飲水。大鼠酒精偏好%=乙醇消耗量(mL)/總液體量(mL)×100%[7]。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分組，對(duì)照組(n=4)和飲酒組(n=42)，對(duì)照組每天記錄24 h飲水量和體重，飲酒組每天記錄24 h總液體攝入量(飲水量+飲酒量)和體重。飲酒第21 d時(shí)，飲酒組給予腦立體定位手術(shù)進(jìn)行埋置套管，術(shù)后恢復(fù)一周，恢復(fù)期間正常飲酒。待飲酒穩(wěn)定后給予酒精戒斷72 h，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(n=6)，DMSO組(n=6)，ACSF組(n=6)，CLP290組(n=6)，VU0240551組(n=6)，BDNF組(n=6)和BDNF+VU0240551組(n=6)。CLP290用DMSO溶解到50 mM，再用ACSF稀釋到50 μM/μL；VU0240551用DMSO溶解到100 mM，再用ACSF稀釋到10 μM/μL；BDNF用ACSF溶解到0.5 μg/μL。每組注射劑量均為1 μL，對(duì)照組注射同等劑量的溶劑。微量注射速度0.5 μL/min，注射完留針2 min，以便藥物擴(kuò)散，藥物注射完30 min后給予飲酒，測(cè)6 h飲酒量和飲水量，計(jì)算酒精偏好。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)作圖采用GraphPad Prism 8.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One way ANOVA方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異后采用事后兩兩比較進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠間歇性飲酒模型的建立

2.1.1 建模期間大鼠體重和24 h總液體攝入量變化 建模階段，飲酒組大鼠體重與對(duì)照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1A，t=0.19，P=0.86)。與對(duì)照組相比，飲酒組大鼠24 h總液體攝入量沒有明顯變化(見圖1B，t=0.06，P=0.95)。

2.1.2 建模期間大鼠飲酒量和酒精偏好變化 隨著飲酒天數(shù)的增加，大鼠酒精攝入量(圖1C)和酒精偏好(圖1D)逐漸增加，到末次飲酒28 d時(shí)已達(dá)到穩(wěn)定水平，代表酒精依賴模型建立成功。

2.2 BDNF對(duì)酒精偏好的影響酒精依賴模型建立成功后給予戒斷72 h，戒斷后給予VTA區(qū)注射BDNF(0.5 μg)，與假手術(shù)組和ACSF組比較，BDNF組酒精偏好顯著降低(見表1，F(xiàn)2,15=7.429，P=0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SD大鼠建模過(guò)程中的變化

2.3 KCC2在酒精偏好中的作用酒精依賴模型建立成功后給予戒斷72 h，戒斷后給予VTA注射KCC2激活劑CLP290(50 μM)或抑制劑VU0240551(10 μM)，與假手術(shù)組和DMSO組比較，CLP290組酒精偏好降低(見表1，F(xiàn)2,15=6.141，P=0.0113)，而VU0240551組酒精偏好升高(表1，F(xiàn)2,15=4.885，P=0.0232)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 VTA注射藥物對(duì)酒精偏好的影響

2.4 KCC2在BDNF抑制酒精偏好中的作用機(jī)制為了進(jìn)一步探究KCC2的作用，我們聯(lián)合注藥BDNF和VU0240551，發(fā)現(xiàn)VU0240551逆轉(zhuǎn)了BDNF對(duì)酒精偏好的抑制作用(見表1，F(xiàn)2,15=6.256，P=0.0106)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

AUD是一種非常常見和復(fù)雜的疾病，因?yàn)榫凭鞘澜缟鲜褂米顝V泛的成癮性物質(zhì)。酒精依賴對(duì)公共衛(wèi)生、社會(huì)和私人生活產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，并造成了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)[8]。酒精暴露主要是作用于各種離子型受體和信號(hào)分子，隨著以AUD為特征的慢性酒精暴露，會(huì)引起神經(jīng)適應(yīng)性改變，導(dǎo)致成癮和復(fù)飲等酒精依賴的特征。

中腦邊緣DA系統(tǒng)起源于VTA，并向伏隔核、背紋狀體、前額葉皮質(zhì)、杏仁核投射，被認(rèn)為與獎(jiǎng)賞有關(guān)[9]，所以本課題組以VTA作為研究對(duì)象。間歇性雙瓶自由獲取20%酒精模式目前被認(rèn)為是操作簡(jiǎn)單、有效、結(jié)果可靠的酒精濫用和依賴的臨床前研究范例，課題組以往研究發(fā)現(xiàn)該模型會(huì)達(dá)到逐步升級(jí)和穩(wěn)定的飲酒基線，并發(fā)現(xiàn)在酒精戒斷72 h時(shí)會(huì)引起再飲酒量升高[7]。所以我們選擇在酒精戒斷72 h給予VTA區(qū)注藥。

BDNF在體內(nèi)主要對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育分化起到促進(jìn)和維持作用，增加突觸的可塑性進(jìn)而影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中與酪氨酸激酶B(Tyrosine receptor kinase B,TrkB)結(jié)合，對(duì)谷氨酸能和GABA能突觸傳遞發(fā)揮作用[10]。臨床前和臨床研究表明BDNF與飲酒、依賴和復(fù)發(fā)有關(guān)[11]，嚙齒動(dòng)物模型研究也表明，酒精暴露增加紋狀體BDNF水平，而BDNF反過(guò)來(lái)通過(guò)激活一種依賴于絲裂原活化蛋白激酶的基因組機(jī)制來(lái)抑制酒精攝入[12]。而我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露會(huì)改變VTA區(qū)BDNF表達(dá)，微量注射BDNF可以減弱大鼠酒精戒斷后的飲酒量和戒斷癥狀[7]。KCC2作為成熟神經(jīng)元主要的氯離子排出體，在中樞神經(jīng)元的生理功能上發(fā)揮著重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理是由于KCC2功能的降低，從發(fā)育畸形、腦腫瘤到神經(jīng)退行性疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)，在VTA區(qū)注入KCC2激活劑CLP290可以減弱大鼠應(yīng)激后的酒精攝入量[6]，也能減弱青春期尼古丁暴露大鼠在成年后的酒精消耗[13]。SD幼鼠聯(lián)合麻醉及產(chǎn)后應(yīng)激，導(dǎo)致成年后杏仁核KCC2發(fā)生顯著變化并增加了酒精攝入量[14]?？梢奒CC2與酒精密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)中，KCC2功能的變化與BDNF-TrkB有關(guān)[15]。為了研究慢性間歇性酒精暴露后KCC2是否參與BDNF對(duì)大鼠戒斷后酒精偏好的影響，我們以SD大鼠為研究對(duì)象，在經(jīng)過(guò)28 d的間歇性雙瓶自由獲取20%酒精后，給予戒斷72 h，在VTA區(qū)微量注射CLP290，發(fā)現(xiàn)CLP290可以減弱大鼠戒斷后的飲酒偏好，而微量注入VU0240551卻增加了大鼠戒斷后的飲酒偏好。由此可見KCC2可以調(diào)節(jié)大鼠酒精戒斷后的飲酒行為。與之前的研究一致，VTA微量注射BDNF可以抑制大鼠戒斷后的酒精偏好，通過(guò)給予KCC2抑制劑VU0240551，發(fā)現(xiàn)VU0240551阻斷了BDNF對(duì)大鼠戒斷后飲酒偏好行為的抑制作用。表明KCC2可能參與BDNF調(diào)控大鼠慢性酒精暴露戒斷后的飲酒行為。

綜上所述，KCC2可以調(diào)控SD大鼠慢性間歇性酒精暴露戒斷后再飲酒時(shí)的飲酒行為，并能影響B(tài)DNF對(duì)酒精戒斷的偏好作用，提示KCC2可能參與BDNF在VTA對(duì)酒精的神經(jīng)回路調(diào)節(jié)，為酒精濫用和依賴的臨床研究提供理論依據(jù)。