甘草苷對刀豆蛋白A誘導的實驗性肝損傷的保護作用及機制

文怡欣，鄂志野，張 珊，聶 影，鞠寶玲，張紅軍

(牡丹江醫(yī)學院免疫學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

中國是病毒性肝炎等慢性肝病的高發(fā)地區(qū)，肝纖維化是慢性肝臟炎癥反應(yīng)的組織修復過程，持續(xù)進展可以發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌[1]，因此尋找有效的抑制慢性肝損傷及抗肝纖維化的藥物及其活性成分具有重要意義。在慢性肝臟疾病的治療過程中，中醫(yī)藥發(fā)揮著重要作用。甘草是我國應(yīng)用最廣泛的中草藥之一[2]，具有多種藥理作用，Liq是甘草中提取的黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)及抗癌等作用。對于治療抑郁癥、糖尿病、胃癌以及肝癌都有作用[3]。因此，本研究擬通過ConA建立與病毒性肝炎發(fā)病機制最為接近的免疫性肝損傷實驗動物模型，探討Liq對實驗性肝損傷是否具有保護作用及可能作用機制，為Liq的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 ConA購自Sigma公司(美國)；Liq購自成都瑞芬思生物公司；TRIZOL試劑購自Appied biosystem技術(shù)有限公司(美國)；qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購自Roche公司(中國)；HE染色試劑購自Leagene Biotechology公司(中國)；Masson染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司(中國)。

1.1.2 實驗儀器 包埋機、旋轉(zhuǎn)式切片機、烘片機(德國Leica)、NanoDrop2000微量RNA濃度分析儀(美國ThermoFisher)、3K15低溫高速離心機(美國Sigma公司)、XH-D漩渦混合器(中國(上海)、生物顯微鏡(德國Leica)、7500熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥處理 SPF級ICR小鼠雌雄各半，8～10周齡，體重18～22 g，由牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心提供。所有小鼠喂養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心動物房[SYXK(黑)2019-006]，生活在(24±2)℃，12 h晝夜節(jié)律的環(huán)境中，自由進食進水。本研究已獲得牡丹江醫(yī)學院動物倫理委員會批準。將32只ICR小鼠雌雄各半隨機分為四組，每組8只分別為對照組、ConA模型組、藥物中劑量(ConA+Liq 40 mg/kg)、藥物治療高劑量(ConA+Liq 80 mg/kg)。模型組及藥物治療組通過小鼠尾靜脈注射ConA 10 mg/kg體重，1次/7 d，連續(xù)6次[4]；對照組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，1次/7 d，連續(xù)6次；第28天開始藥物中劑量組給予Liq 40 mg/kg體重、藥物治療高劑量組給予Liq 80 mg/kg體重灌胃[5]，1次/d，連續(xù)14 d；對照組及模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；第42天各組小鼠經(jīng)摘眼球取血分離血清用于血清酶學檢測；經(jīng)脊髓離斷處死，獲得肝組織與脾臟組織。一部分肝臟組織存放于-80 ℃超低溫冰箱用于qRT-PCR檢測，剩余部分存放于4%多聚甲醛中固定用于組織學檢測。

1.2.2 血清酶學檢測 分離的血清用于檢測ALT、AST的含量，采用牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院檢驗科邁瑞B(yǎng)S-2000全自動生化分析儀，檢測步驟按制造廠商提供的說明書操作。

1.2.3 HE染色 將固定的實驗肝臟組織進行脫水、浸蠟、包埋，切成4～5 μm厚的切片，常規(guī)脫蠟、復水，按照標準步驟進行蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察組織病理情況。

1.2.4 MASSON染色 石蠟切片放入烘箱，隨后放入二甲苯中(脫蠟)，然后依次浸梯度酒精里3 min，隨后用蒸餾水輕輕洗2 min，再按照MASSON染色試劑盒說明書步驟進行染色，隨后用梯度酒精快速脫水，用二甲苯透明，最后用中性樹膠進行封片，在顯微鏡下進行觀察。 通過Image J 分析軟件計算膠原纖維面積(%)=膠原纖維面積/總面積

1.2.5 qRT-PCR 在冰盒上進行肝臟組織的研磨，采用傳統(tǒng)的TRIzol試劑方法提取肝臟組織中的總RNA，超微量核酸檢測儀對總RNA的濃度進行檢測。采用用羅氏逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)說明書進行操作。采用SYBRGREEN進行熒光定量表達目的基因的mRNA，反應(yīng)體系根據(jù)說明書配置成20 μL反應(yīng)液，并將GAPDH擴增作為內(nèi)參基因，用循環(huán)數(shù)閾值表達水平，采用2-△△CT法分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計學分析計量資料均采用“均數(shù)±標準差”表示，多組間差異的比較采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行單因素方差分析確定，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Liq可改善實驗性肝損傷

2.1.1 血清酶學檢測結(jié)果 與對照組相比，ConA模型組的AST以及ALT明顯增加(P<0.05)，與ConA模型組相比，藥物治療組中劑量組以及高劑量組的AST以及ALT的水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST水平變化

2.1.2 組織病理學檢測結(jié)果 對照組小鼠的肝臟表面光滑細膩，紅潤，質(zhì)地柔軟，無出血點等。ConA模型組小鼠的肝臟肉眼可見表面顆粒狀，可見點狀出血點，并且顏色瘀紅，質(zhì)地較硬。藥物治療組可見組織大體上可見顏色以及質(zhì)地有所改善，顆粒狀出血點減輕等，見圖1A。HE染色可見對照組小鼠的組織切片染色可見中肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細胞形態(tài)完整，細胞核形態(tài)均正常。ConA模型組小鼠肝組織切片染色可見肝臟小葉結(jié)構(gòu)破壞，有大片組織壞死，細胞腫脹，伴有脂肪變性和胞質(zhì)空洞化等。中劑量治療組以及高劑量治療組中分別小鼠的肝臟組織可見明顯的好轉(zhuǎn)，見圖1B，壞死面積明顯有所改善，細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有好轉(zhuǎn)。MASSON染色中膠原纖維表現(xiàn)為藍色，對照組小鼠肝臟組織中未見藍色膠原纖維表達，ConA模型組小鼠的膠原表達量增高，中劑量組與高劑量組小鼠肝臟組織的膠原表達量膠原表達量降低(P<0.05)，見圖1C，表3。從以上肝臟組織標本以及HE染色和MASSON染色分析觀察可得Liq能夠改善實驗性肝損傷。

圖1 實驗動物肝臟組織病理學表現(xiàn)

表3 各組小鼠肝臟組織膠原纖維表達量

2.2 Liq對ConA誘導的HSC活化的影響與對照組相比，ConA模型組肝臟組織col1a1、α-SMA的mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)，這表示ConA誘導的慢性實驗性肝損傷過程中存在HSC的活化。與ConA模型組比較，藥物治療中劑量組和藥物治療高劑量組肝臟組織col1a1及α-SMA的mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，這提示Liq可能通過抑制HSC活化來減緩實驗性肝損傷，見表4。

表4 各組小鼠Col1a1、α-SMA表達情況

2.3 Liq對ActivinA/Smad通路的影響與正常對照組相比，ConA模型組當中ActivinA、ACVR2A、smad2mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)，這表明ActivinA信號傳導通路參與了ConA誘導的實驗性肝損傷過程。與ConA模型組相比，ActivinA、ACVR2A和smad2在藥物治療中劑量組以及藥物治療高劑量組當中的表達明顯下調(diào)(P<0.05)，這表明Liq可通過調(diào)節(jié)ActivinA/smad通路來緩解實驗性肝損傷，見表5。

表5 各組小鼠Activina、ACVR2A、Smad2表達情況

3 討論

慢性肝損傷持續(xù)進展可發(fā)展為肝纖維化[6]，是肝硬化、肝衰竭、甚至肝癌的潛在因素，因此迫切的需要尋找一種安全有效、毒副作用小的藥物來進行干預。目前西藥治療僅限于一種蛋白和一個靶點上進行，且副作用大，長期用藥會逐漸依從性降低，影響治療療效。而中藥治療疾病主要是通過多靶點、多途徑來進行的[7]，并且具有安全副作用小、來源廣泛等多種優(yōu)點。因此用中藥來治療疾病已成為當前熱門研究領(lǐng)域。Liq主來源于甘草[8]，是甘草中提取出來的一種黃酮類活性成分，有研究表明，Liq具有抗癌作用、抗抑郁、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種作用。

ConA是一種植物凝集素[9]，ConA誘導的實驗性肝損傷的發(fā)病機制主要是引起肝臟中的T細胞的活化與募集，聯(lián)合天然免疫以及適應(yīng)性免疫產(chǎn)生多種效應(yīng)性細胞以及分子，引起肝組織內(nèi)大量炎性細胞浸潤并伴隨著肝臟組織損傷及壞死。本研究顯示ConA連續(xù)給藥處理后，實驗動物血清ALT、AST水平明顯升高，肝臟組織肉眼可見表面粗糙并伴有點狀出血，組織切片染色可見肝臟結(jié)構(gòu)破壞，小葉結(jié)構(gòu)消失，細胞腫脹，胞質(zhì)空泡化及脂肪變性，伴有大面積組織壞死及炎性細胞浸潤，通過MASSON染色可見ConA模型組肝臟組織膠原含量增加，以上說明本研究成功建立肝損傷模型。Liq連續(xù)灌胃給藥兩周后，從血清ALT、AST水平到組織病理改變，實驗動物肝臟損傷程度明顯減輕，說明Liq對ConA誘導的肝損傷具有改善及治療功效。

在正常生理情況下，肝臟具有能分泌膽汁，參與食物的消化以及物質(zhì)代謝、解毒防御等功能。在肝臟受到來自各種因素慢性損傷后，肝纖維化是慢性損傷進展的重要病理過程[10]，形成機制主要由于HSC的活化產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)和膠原沉積,破壞正常肝臟結(jié)構(gòu)，導致肝臟功能異常。col1a1和α-SMA是HSC活化的重要指標，本研究表明，在ConA模型組肝臟組織中col1a1和α-SMA的mRNA表達水平明顯升高，而在給予Liq藥物治療后，其col1a1和α-SMA的mRNA表達水平明顯下降。這表明Liq可通過抑制HSC活化來緩解肝損傷。

HSC活化受多種細胞信號的調(diào)控，我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，ActivinA在實驗性性肝損傷模型動物肝臟組織中高表達[11]，具可誘導HSC活化，抑制肝細胞的增殖，誘導肝細胞凋亡等作用，是重要的致纖維化因子。本研究表明，在給與ConA刺激后實驗動物肝臟組織ActivinA、ACVR2A以及其相關(guān)下游信號蛋白Smad2的mRNA表達水平明顯升高，Liq給藥后ActivinA、ACVR2A以及Smad2的mRNA表達水平明顯下降，與ConA模型組比較差異顯著，這表明Liq可能通過調(diào)控ActivinA/Smad信號通路，發(fā)揮其保肝作用。

綜上所述，Liq具有緩解肝損傷作用，其作用機制可能是通過其抑制HSC活化以及調(diào)控ActivinA/Smad信號通路來發(fā)揮其保肝作用。