不同月齡灘羊背最長(zhǎng)肌組織的基因表達(dá)譜分析

馬麗娜，蔣秋斐，馬 青，額爾和花*

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站，寧夏銀川 750001）

灘羊是主要分布于我國(guó)寧夏、甘肅等西部省份的優(yōu)良裘皮用綿羊品種，除生產(chǎn)聞名于世的二毛皮之外，其肉質(zhì)具有細(xì)嫩、不膻不膩等特點(diǎn)，受到消費(fèi)者的廣泛青睞。但灘羊與杜泊羊等國(guó)外優(yōu)秀肉用綿羊品種相比，存在生長(zhǎng)發(fā)育速度較慢的劣勢(shì)，難以滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（RNA-seq）是解析家畜肌肉發(fā)育機(jī)理、篩選相關(guān)候選基因的常用技術(shù)手段，許多學(xué)者利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的山羊背最長(zhǎng)肌的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析，并廣泛應(yīng)用于灘羊被毛卷曲、長(zhǎng)脂尾等特定性狀密切相關(guān)的候選基因及信號(hào)通路的研究，但是利用該技術(shù)篩選與灘羊肌肉發(fā)育相關(guān)候選基因的研究還相對(duì)較少。以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)日趨成熟，顯著加快了豬、牛、羊等家養(yǎng)動(dòng)物新品種的精準(zhǔn)培育進(jìn)程。因此，篩選灘羊肌肉發(fā)育相關(guān)的候選基因，解析相關(guān)基因調(diào)控灘羊肌肉發(fā)育的分子機(jī)理，是利用基因編輯技術(shù)培育生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)優(yōu)良的灘羊新品種的基礎(chǔ)性工作。研究發(fā)現(xiàn)，34～36 kg 體重階段為育肥灘羊的最佳屠宰體重，灘羊體重在32～34 kg 時(shí)羊肉品質(zhì)最佳，通過(guò)優(yōu)質(zhì)灘羊胴體標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)的推廣應(yīng)用，出欄活重達(dá)到41～45 kg，9 月齡（體重33.89 kg±1.80 kg）灘羊肉嫩度、熟肉率、粗脂肪等指標(biāo)最優(yōu)?；谇捌趫F(tuán)隊(duì)研究成果，本研究選取3 種不同體重階段（體重4.83 kg±0.61 kg、34.71 kg±3.77 kg、體重42.62 kg±5.71 kg）的灘羊背最長(zhǎng)肌組織，采用RNA-seq 技術(shù)對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，旨在篩選到與灘羊肌肉發(fā)育相關(guān)的可靠候選基因用于后續(xù)功能驗(yàn)證，進(jìn)而為通過(guò)基因編輯技術(shù)快速培育生長(zhǎng)發(fā)育速度快的灘羊新品種提供備選基因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選取9 只健康狀況良好的鹽池灘羊，按照出生日期和體重分為3 組：A 組（1 月齡，體重4.83 kg±0.61 kg）、B 組（6 月齡，體重34.71 kg±3.77 kg）和C 組（10 月齡，體重42.62 kg±5.71 kg），每組各3 只，且體重相近。該實(shí)驗(yàn)羊飼喂于寧夏朔牧鹽池縣灘羊有限公司（位于寧夏吳忠市鹽池縣），按照不同階段灘羊相關(guān)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。屠宰后采集背最長(zhǎng)肌組織樣品約20 g，經(jīng)無(wú)菌PBS 沖洗2 次后，迅速分成若干小塊，分裝入凍存管中置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 背最長(zhǎng)肌組織總RNA 提取及建庫(kù)測(cè)序 采用Trizol法提取灘羊背最長(zhǎng)肌組織總RNA，具體操作步驟如下：把約100 mg 背最長(zhǎng)肌組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，至組織研磨成粉末狀轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中；加入1 mL Trizol 試劑，顛倒混勻，室溫孵育2 min；加氯仿0.2 mL，劇烈上下顛倒離心管若干次，充分混勻，室溫下靜置3 min；4℃ 12 000 r/min 離心15 min，吸取上層水相至另外一個(gè)新離心管中，加入等體積異丙醇，充分顛倒混勻，靜置10 min；4℃ 12 000 r/min 離心15 min后小心棄掉上清液，加入無(wú)酶水配置的75% 乙醇，吹打若干次，4℃ 12 000 r/min 離心5 min；小心棄掉液體，室溫下放置5 min，加入50 μL 無(wú)酶水溶解白色沉淀；最后，采用NanoDrop 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 純度和濃度，采用Agilent 2100 檢測(cè)RNA 完整度，凝膠電泳檢測(cè)RNA 降解度。

待所有樣品檢測(cè)合格后，各取2 μL RNA 用于建庫(kù)測(cè)序。具體建庫(kù)流程如下：使用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入片段化緩沖液將mRNA 打斷成短片段；用六堿基隨機(jī)引物以mRNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，再加入緩沖液、dNTPs 和DNA 聚合酶I 合成第2 鏈cDNA；利用AMPure XP 磁珠純化雙鏈cDNA；對(duì)純化后的雙鏈cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)、加A和接頭；通過(guò)AMPureXP 磁珠對(duì)雙鏈cDNA 進(jìn)行片段大小選擇，選擇大小在200～250 bp 的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以構(gòu)建cDNA 文庫(kù)；最后，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，采用Illumina Hiseq4000 測(cè)序平臺(tái)PE150（paired-end）測(cè)序策略上機(jī)測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與參考基因組比對(duì) 將上述測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)即Raw data（Raw Reads）通過(guò)北京奧維森基因科技有限公司開(kāi)發(fā)的Perl 腳本進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，具體內(nèi)容如下：使用Trimmomatic（v0.33）軟件去除帶有測(cè)序接頭的Reads、不確定堿基含量比例大于10% 的reads 以及低質(zhì)量堿基即Q ≤20 含量大于50% 的reads，最終得到凈數(shù)據(jù)即Clean Data（Clean Reads）。對(duì)所得凈數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將Q20>95%、Q30>89%（Q20、Q30：Phred 質(zhì)量值大于20、30 的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例）定義為測(cè)序質(zhì)量好的數(shù)據(jù)，用于后續(xù)比對(duì)及數(shù)據(jù)分析。采用Tophat 2（v2.1.0）軟件將上述質(zhì)控所得凈數(shù)據(jù)與最新版的綿羊參考基因組序列（序列號(hào)：GCF_002742125.1）進(jìn)行比對(duì)。

1.4 轉(zhuǎn)錄本的組裝及基因表達(dá)水平分析 采用Cufflinks（v2.1.1）軟件對(duì)上述比對(duì)到參考基因組上的凈讀數(shù)進(jìn)行組裝，利用Cuffcompare 程序和已知的參考基因序列進(jìn)行比較，以發(fā)現(xiàn)未注釋的新基因或者已知基因新的外顯子，同時(shí)可以優(yōu)化已知基因的起始和終止位置。采用HTSeq（v0.5.4p3）軟件對(duì)不同月齡灘羊背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，以FPKM（Fragments Per Kilobase Of Exon Model Per Million Mapped Reads）即每百萬(wàn)Reads 中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的Fragments 數(shù)目以校正測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)測(cè)序所得Reads 計(jì)數(shù)的影響，從而客觀衡量基因表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)選擇以FPKM 值1 作為基因表達(dá)與否的標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)的分析只選擇FPKM ≥1 的基因。

1.5 不同樣本間的差異表達(dá)基因分析 采用上述步驟中基因表達(dá)水平分析所得到的FPKM 值來(lái)比較基因在不同組別樣本間的表達(dá)，使用軟件為DESeq（1.10.1），所得差異表達(dá)分析結(jié)果值使用Benjamini 和Hochberg方法控制FDR（False Discovery Rate）。差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)一般為：值<0.05。

1.6 差異表達(dá)基因GO 和KEGG 富集分析 采用GOseq（v1.22）軟件對(duì)不同組別背最長(zhǎng)肌樣本間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，準(zhǔn)確計(jì)算基因所富集分子功能（Molecular Function）、生物過(guò)程（Biological Process）和細(xì)胞 組成（Cellular Component）3 個(gè)GO分類條目及子條目的概率；采用KOBAS3.0對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析，確定差異表達(dá)基因所參與的最主要生化途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果 為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選和3 個(gè)在不同階段表達(dá)逐步上調(diào)的基因和和3個(gè)在不同階段表達(dá)逐步下調(diào)的基因進(jìn)行驗(yàn)證，以-作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行驗(yàn)證，引物信息見(jiàn)表1。試劑采用北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的FastSYBR Mixture（CW0955S），反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，2×Fast SYBR Mixture 10 μL，模板cDNA（20 μg/μL）1 μL，ddHO 補(bǔ)足至20 μL。PCR 采取試劑說(shuō)明書(shū)所推薦兩步法：95℃預(yù)變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)，采集熒光；65～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。采用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，以1 月齡樣本作為對(duì)照組。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 組織所提取總RNA 質(zhì)量檢測(cè) 由表2 可知，所有樣本所提取總RNA 的OD和OD比值均在1.8～2.0 之間，RIN（RNA Integrity Number）值在7.5～8.4之間，符合RNA-seq 測(cè)序?qū)嶒?yàn)對(duì)RNA 質(zhì)量的一般要求。上述結(jié)果說(shuō)明所有樣本提取RNA 質(zhì)量良好，可用于下游的RNA-seq 實(shí)驗(yàn)。

表2 背最長(zhǎng)肌組織RNA 提取質(zhì)量檢測(cè)

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及參考基因組比對(duì) 由表3 可知，各個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)的原始讀數(shù)在39 440 656～56 556 972 之間，原始?jí)A基數(shù)在5.9～8.48G 之間；凈讀數(shù)在38 855 940～55 525 176 之間，凈堿基數(shù)在5.82～8.32G 之間；測(cè)序堿基的錯(cuò)誤率均為0.02%，Q20 值在98.09%～98.81%之間，Q30 值在94.11%～96.09%之間，GC 含量在50.81%～51.88%之間。上述各項(xiàng)指標(biāo)均符合精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行下一步分析。

表3 背最長(zhǎng)肌組織原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

采用Tophat2（v2.1.0）軟件將各個(gè)樣本建庫(kù)獲得的凈讀數(shù)匹配到綿羊參考基因組上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4）：各個(gè)樣本93.5%～94.59% 的凈讀數(shù)都能匹配到參考基因組上；在匹配到參考基因組上的凈讀數(shù)中，72.08%～76.94%的讀數(shù)匹配到基因外顯子區(qū)域，7.20%～10.02%的讀數(shù)匹配到基因內(nèi)含子區(qū)域，而15.63%～18.07% 的讀數(shù)匹配到基因間區(qū)域。該現(xiàn)象符合匹配到基因外顯子區(qū)域的讀數(shù)在匹配讀數(shù)占比最高的正常情況，同時(shí)匹配到內(nèi)含子區(qū)域的讀數(shù)來(lái)源于前體mRNA 的殘留及在前體mRNA 發(fā)生可變剪切形成成熟mRNA 過(guò)程中的內(nèi)含子保留事件，而定位到基因間區(qū)域的讀數(shù)可能是由于目前參考基因組注釋不完備引起的。

表4 背最長(zhǎng)肌組織凈讀數(shù)的參考基因組比對(duì)情況

2.3 基因表達(dá)定量分析 在對(duì)匹配到參考基因組上的凈讀數(shù)進(jìn)行組裝后，采用FPKM 值表示基因的表達(dá)量并對(duì)所有基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1 所示?？梢?jiàn)，不同組別樣本小提琴圖具有類似的形狀，表明不同組別樣本的基因表達(dá)在整體上高度類似。

圖1 不同樣本基因表達(dá)定量分析

2.4 差異表達(dá)基因篩選 由圖2 可知，6 月齡組和1 月齡組相比，差異表達(dá)基因共664 個(gè)，上調(diào)基因236 個(gè)，下調(diào)基因428 個(gè)；10 月齡組和1 月齡組相比，差異表達(dá)基因共2 131 個(gè)，上調(diào)基因927 個(gè)，下調(diào)基因1 204個(gè)；10 月齡組和6 月齡組相比，差異表達(dá)基因共442個(gè)，表達(dá)上調(diào)基因188 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因254 個(gè)。對(duì)不同比較組之間上調(diào)的基因取交集發(fā)現(xiàn)，共有的上調(diào)基因10 個(gè)，包括等已知促進(jìn)不同物種肌肉發(fā)育相關(guān)的基因；共有的下調(diào)基因16 個(gè)，包括等已知的抑制肌肉發(fā)育相關(guān)的基因。相關(guān)基因在不同組別樣本間的表達(dá)水平（以FPKM 表示）見(jiàn)表5。

表5 3 個(gè)比較組別間共有的差異表達(dá)基因

圖2 不同組別差異表達(dá)基因火山圖

2.5 差異表達(dá)基因的GO 分析 采用GOseq 軟件對(duì)不同組別間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，將同基因歸類到GO 三大分類及所屬子條目中，結(jié)果如圖4 所示。可知，1 月齡組和6 月齡組差異基因所富集到的生物過(guò)程包括刺激響應(yīng)、免疫響應(yīng)和免疫系統(tǒng)過(guò)程等，富集到的細(xì)胞組分包括外切脫氧核糖核酸酶7 復(fù)合物等，而富集到的分子功能包括核苷結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和GTP 結(jié)合等；1 月齡組和10 月齡組差異基因所富集到的生物過(guò)程包括生物合成過(guò)程、小分子代謝過(guò)程和含氧酸代謝過(guò)程等，富集到的細(xì)胞組分包括膠原蛋白三聚物，而富集到的分子功能包括催化活性、氧化還原酶活性和焦磷酸酶活性等；6 月齡組和10 月齡組差異基因所富集到的生物過(guò)程包括免疫響應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程和多細(xì)胞生物發(fā)育等，細(xì)胞組分包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、三磷酸甘油脫氫酶復(fù)合物和RNA 聚合酶III 復(fù)合物等，而分子功能包括蛋白結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合和信號(hào)受體激活子活性等。

圖3 不同組別差異表達(dá)基因GO 分析

圖4 不同組別差異基因KEGG 分析

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG 分析 由圖4 可知，1 月齡組和6 月齡組差異基因共富集到263 條KEGG 通路，其中前20 條顯著富集的信號(hào)通路包括病毒性心肌炎、心肌細(xì)胞腎上腺激素信號(hào)通路、心肌收縮和擴(kuò)張性心肌病等；1 月齡組和10 月齡組差異基因共富集到315 條KEGG 通路，其中前20 條顯著富集的信號(hào)通路包括胰島素分泌、胰島素抗性、胰高血糖素信號(hào)通路、ECM-受體互作、心肌細(xì)胞腎上腺激素信號(hào)通路和AMPK 信號(hào)通路等；6 月齡組和10 月齡組差異基因共富集到233條KEGG 通路，其中前20 條顯著富集的信號(hào)通路包括癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、MAPK 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡等。

2.7 測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR 驗(yàn)證 如圖5 所示，通過(guò)qRT-PCR 檢 測(cè)和基因在不同月齡組織樣本間的表達(dá)趨勢(shì)同RNA-seq 完全一致，而和基因的表達(dá)趨勢(shì)同RNA-seq 略有差異，具體表現(xiàn)為6 月齡組和10 月齡組表達(dá)量均顯著低于或者高于1 月齡組，同RNA-seq 結(jié)果相符，但前2 組之間基因表達(dá)趨勢(shì)同RNA-seq 結(jié)果不同。上述結(jié)果表明，和可以作為候選基因直接進(jìn)行下一步的功能驗(yàn)證，而和還需要進(jìn)一步的分析。

圖5 qRT-PCR 驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

3 討論

本研究利用RNA-seq 技術(shù)構(gòu)建了不同月齡灘羊背最長(zhǎng)肌組織的基因表達(dá)譜并通過(guò)生信分析，成功篩選到了甲基轉(zhuǎn)移酶樣1（Methyltransferase Like 1，METTL1）、泛素特異性蛋白酶43（Ubiquitin Specific Peptidase 43，USP43）等調(diào)控灘羊肌肉發(fā)育的候選基因?，F(xiàn)有研究證實(shí)：動(dòng)物在出生后主要依賴肌纖維體積的增加而實(shí)現(xiàn)肌肉的生長(zhǎng)，而該過(guò)程與肌衛(wèi)星細(xì)胞密切相關(guān)。肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌肉中通常處于靜息狀態(tài)的肌源性干細(xì)胞，在接受其所附屬肌纖維、周圍微環(huán)境等來(lái)源的信號(hào)后被激活，持續(xù)增殖和分化形成肌細(xì)胞、肌管，同已有肌纖維融合，最終增加肌纖維的體積和長(zhǎng)度。因此，推測(cè)本研究中篩選到的候選基因和信號(hào)通路可能同灘羊出生后肌肉中肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖和分化密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，等基因在出生后灘羊背最長(zhǎng)肌組織的表達(dá)量逐步上升，表明它們是可能促進(jìn)灘羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵基因?；蛞驯话l(fā)現(xiàn)是維持小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的必需基因，而自我更新是肌衛(wèi)星細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞分裂產(chǎn)生相同細(xì)胞以維持干細(xì)胞池中細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定的主要方式。芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白（）基因亦被發(fā)現(xiàn)通過(guò)刺激小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化而參與肌肉再生過(guò)程，表明該基因是動(dòng)物出生后肌肉發(fā)育的重要參與者，因此可能通過(guò)刺激出生后灘羊肌肉中肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化而促進(jìn)灘羊肌肉組織的發(fā)育。在不同階段灘羊背最長(zhǎng)肌肌肉組織中表達(dá)量較高且也呈逐步上升的趨勢(shì)，其已被證實(shí)參與雞肌衛(wèi)星細(xì)胞分化成為肌管的過(guò)程而不影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的過(guò)程。同時(shí)，Miao 等發(fā)現(xiàn)在不同生長(zhǎng)發(fā)育速度的陶賽特和小尾寒羊背最長(zhǎng)肌組織表達(dá)量存在顯著差異，暗示該基因可能同綿羊肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控有關(guān)。此外，基因的單核苷酸多態(tài)性也被發(fā)現(xiàn)同豬、牛等家畜肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)同人肌衛(wèi)星細(xì)胞的晚期增殖和早期分化有關(guān)，且在處于靜息期的肌衛(wèi)星細(xì)胞中不表達(dá)，說(shuō)明的表達(dá)與肌衛(wèi)星細(xì)胞由靜息期向增殖分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變相關(guān)。同時(shí)，也有研究證實(shí)與小鼠鍛煉誘導(dǎo)的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化導(dǎo)致的骨骼肌肉再生有關(guān)。結(jié)合上述基因在出生后灘羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)模式和在其他動(dòng)物上的已有研究推測(cè)，上述基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新、增殖和分化等來(lái)促進(jìn)出生后灘羊肌肉組織的發(fā)育。

同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)一些在灘羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量逐步下調(diào)的基因，說(shuō)明這些基因可能在灘羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著負(fù)向調(diào)控的作用。其中，在小鼠中的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)育遲緩，而這種現(xiàn)象同維持肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)而抑制其增殖分化有關(guān)。也是參與骨骼肌能量代謝的基因之一，其被發(fā)現(xiàn)特異性地表達(dá)于豬骨骼肌中且在肌肉發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，同時(shí)在約克夏豬背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量高于梅山豬，而且基因單核苷酸多態(tài)性同眼肌面積等肉質(zhì)性狀相關(guān)。但是本研究發(fā)現(xiàn)該基因在灘羊肌肉組織發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，暗示該基因可能是灘羊肌肉發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，這種不一致可能與物種特異性有關(guān)?？紤]到與肌肉發(fā)育和肉質(zhì)的密切相關(guān)性，未來(lái)的工作需要進(jìn)一步探索其在灘羊肌肉組織發(fā)育的功能和相應(yīng)的分子機(jī)理。

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 和KEGG 功能富集發(fā)現(xiàn)，免疫響應(yīng)、胰島素分泌和MAPK 等生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路都得到了顯著富集。免疫細(xì)胞是肌肉的重要組成部分，它們可以通過(guò)分泌TNF-等因子調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的過(guò)程。胰島素可以刺激綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，而MAPK 信號(hào)通路活化與靜息期肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活密切相關(guān)。上述信號(hào)通路的顯著富集不僅說(shuō)明它們?cè)跒┭蚣∪饨M織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，而且也暗示調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路可能是促進(jìn)灘羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化、加速肌肉發(fā)育的潛在手段。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)RNA-seq 技術(shù)對(duì)1 月齡、6 月齡和10月齡灘羊背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，通過(guò)對(duì)不同階段差異表達(dá)基因取交集，成功篩選到了等10 個(gè)促進(jìn)灘羊肌肉發(fā)育的候選基因及等16個(gè)起負(fù)向調(diào)控作用的基因；通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集，發(fā)現(xiàn)免疫響應(yīng)、胰島素分泌和MAPK 等信號(hào)通路是參與灘羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。上述候選基因和信號(hào)通路的成功篩選為通過(guò)基因編輯等技術(shù)手段培育生長(zhǎng)發(fā)育速度快的灘羊新品種提供了可靠信息。