一株芘降解菌的分離鑒定及其特性初步研究

張?zhí)煊? 王美琴 劉龍祥 任麗麗 馬燕陽 翟振龍 樊平 吳濤

摘 要：以黃河三角洲重鹽堿地原油污染區(qū)健康生長的鹽生植物蘆葦、稗草、鹽地堿蓬為材料，采用芘為碳源，分離篩選具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌，并研究其促進(jìn)植物生長的特性。結(jié)果表明，篩選得到7株植物內(nèi)生細(xì)菌具有溶解有機(jī)磷能力，7株菌7d對多環(huán)芳烴芘的降解率為59%～78%，其中菌株LDD3的降解效果較為顯著，降解率達(dá)到78%。經(jīng)分子鑒定，菌株LDD3為施氏假單胞菌，在WB培養(yǎng)基和芘培養(yǎng)基中對數(shù)生長期分別為4～16h、24h～48h，最適生長鹽度范圍為1%～3%。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生細(xì)菌;芘;降解;施氏假單胞菌

中圖分類號 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0029-04

Isolation， Identification and Characterization of a Pyrene Degrading Strain

ZHANG Tianyu1? ?WANG Meiqin1? ?LIU Longxiang1? ?REN Lili1? ?MA Yanyang1? ?ZHAI Zhenlong1

FAN Ping2? ?WU Tao1，3

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta， College of Biological and Environmental Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， China; 2Binzhou Agriculture and Rural Bureau， Binzhou 256601， China; 3Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta， Binzhou University， Binzhou 256600， China）

Abstract： Using the healthy halophytes Phragmites australis， Echinochloa crusgalli and Suaeda salsa growing in the heavy saline alkali soil oil polluted area of the Yellow River Delta as materials and pyrene as carbon source， the plant endophytic bacteria with pyrene degradation function were isolated and screened， and their plant growth promoting characteristics were studied. The results showed that the seven strains of plant endophytic bacteria had the ability to dissolve organic phosphorus. The degradation rate of polycyclic aromatic pyrene was 59%～78% in 7 days， and the degradation rate of strain LDD3 was 78%. By molecular identification， strain LDD3 was Pseudomonas schneider. The logarithmic growth periods of LDD3 in WB medium and pyrene medium were 4～16h and 24h～48h respectively. The optimum growth salinity range of strain LDD3 is 1%～3%.

Key words： Plant endophytic bacteria; Pyrene; Degradation; Pseudomonas schneider

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類常見的具有“三致效應(yīng)”的有機(jī)污染物，主要來源于化石燃料燃燒、生活垃圾焚燒以及化工行業(yè)排放的廢棄物等，容易在土壤中累積，同時能夠通過地球化學(xué)循環(huán)進(jìn)入大氣、水體，造成二次污染[1]。PAHs具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性、脂溶性和累積性，極易被動物腸胃吸收，并通過食物鏈放大而富集[2]。因此，控制和治理PAHs污染是當(dāng)前面臨的重要的環(huán)境問題之一。當(dāng)前，PAHs污染土壤治理方法主要有物理、化學(xué)、生物修復(fù)，其中生物修復(fù)相比于物理、化學(xué)修復(fù)，具有經(jīng)濟(jì)簡便、環(huán)境友好及無二次污染的優(yōu)點，是修復(fù)環(huán)境中PAHs污染最具前景的方法，能夠降解PAHs污染物特性植物內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為植物修復(fù)PAHs污染帶來了新的研究方向。目前，研究人員已從植物中篩選出若干種可促進(jìn)植物代謝體內(nèi)PAHs污染物的功能內(nèi)生細(xì)菌，這些研究主要集中在萘、菲等低分子量PAHs污染物。芘是由4個苯環(huán)對稱排列組成的PAHs，作為高分子量PAHs，其在環(huán)境中穩(wěn)定存在[3]。目前，篩選分離降解芘等高分子量多環(huán)芳烴的植物內(nèi)生細(xì)菌研究還少有報道。

本研究以黃河三角洲重鹽堿原油污染地區(qū)健康生長的鹽生植物（稗草、鹽地堿蓬、蘆葦）為材料，采用芘為PAHs代表物，分離篩選出具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其鑒定，并研究其促生和耐鹽特性，為PAHs污染土壤的生物修復(fù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 植物樣品采自黃河三角洲地區(qū)油井旁鹽漬化土壤上健康生長的蘆葦、稗草、鹽地堿蓬。

1.2 培養(yǎng)基 SL-6（g/L）：ZnSO4·7H2O 0.10，MnCl2·4H2O 0.03，H3BO3 0.30，CoCl2·6H2O 0.20，CuCl2·2H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na2WO4·2H2O 0.03，pH為7.8±0.2。

SL-4（g/L）：FeSO4·7H2O 0.002，10%微量元素溶液SL-6。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 17.90，NaH2PO4·2H2O 7.80，（NH4）2SO4 5.00，KCl 5.00，1%微量元素溶液SL-4。

WB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基與無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行1∶1比例混合制備而成。

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[4]方法。

PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[4]方法。

1.3 芘降解菌的分離 新鮮植物樣品用自來水沖洗35min，再用無菌水沖洗4次，每次沖洗時間4min。用滅菌濾紙吸干植物表面水分，用無菌剪刀將植物分為地上部和地下部，分別用70%酒精浸泡2min，無菌水清洗4次，3%NaClO浸泡2次，每次浸泡時間為1min，再用無菌水清洗4次，每次3min。經(jīng)以上處理完的樣品放在LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時之后，檢測表面是否滅菌完全[5]。將上述樣品分別稱量5g，加入10倍體積PBS溶液，研磨，吸取5mL上清液轉(zhuǎn)到50mL濃度為50mg/L的芘培養(yǎng)基中，25℃，180r·min-1培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)接5次，梯度稀釋，涂布，25℃恒溫培養(yǎng)。待長出單菌落后純化3次，得到功能菌株[6]。

1.4 高效芘降解菌株的篩選 將分離純化得到的菌株接種于含芘液體培養(yǎng)基，設(shè)置3個對照，每株菌設(shè)3次重復(fù)。28℃、160r/min條年下振蕩培養(yǎng)7d，測定培養(yǎng)基中芘濃度。培養(yǎng)基中芘濃度測定方法：將含芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入100mL離心管，加等體積正己烷，渦旋振蕩1min，靜置，取有機(jī)相用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，硅膠柱純化，用高效液相色譜儀測定芘含量。高效液相色譜條件：C18反相色譜柱，流動相V（甲醇）∶V（超純水）=80∶20，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，進(jìn)樣量20μL，時間12min。

1.5 菌種鑒定 菌種分子鑒定由中美泰和公司進(jìn)行，利用鄰接法在MEGA.7軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株溶磷特性試驗 分別以Ca3（PO4）2、卵磷脂代表無機(jī)磷和有機(jī)磷。采用點接法接種于有機(jī)磷和無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)，觀察是否產(chǎn)生溶磷透明圈。

1.7 生長及耐鹽特性 生長曲線測定：準(zhǔn)確吸取10mL細(xì)菌過夜培養(yǎng)液（培養(yǎng)10～12h），按照5%接種量接種到190mLWB培養(yǎng)基或者，28℃、160r/min培養(yǎng)，每隔2h取樣，在600nm下測定吸光度。設(shè)置無菌組作為對照，每株菌設(shè)置3個重復(fù)。菌株在芘培養(yǎng)基條件下的生長曲線操作步驟同WB培養(yǎng)基，取樣時間每隔為12h。耐鹽特性：吸取1mL對數(shù)期的菌懸液分別接種到NaCl濃度為1%、3%、5%、7%、9%、11%的10mLWB培養(yǎng)基中，設(shè)置3個重復(fù)。在160r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，600nm測其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選的芘降解菌 通過選擇性富集培養(yǎng)，從黃河三角洲鹽漬化石油污染區(qū)健康植物體內(nèi)分離篩選出7株具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌，編號分別為LDD3、YDB1、LDB7、YUA6、LDB11、LUD5、LDC7。通過搖瓶培養(yǎng)，測定菌株降解芘能力，各株菌降解對芘的降解率如圖1所示。由圖1可知，7株菌對芘的降解率均達(dá)到55%以上，其中LDD3對芘的降解率最高，達(dá)到78%。因此，選擇菌株LDD3作進(jìn)一步研究。

2.2 芘降解菌株溶磷能力 將高效降解菌LDD3分別點接于無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7d后，菌株在有機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶磷透明圈，在無機(jī)磷培養(yǎng)基上未產(chǎn)生溶磷圈，說明菌株LDD3具有溶解有機(jī)磷的能力。

2.3 芘降解菌株所屬菌種鑒定 菌株LDD3經(jīng)16S rDNA基因測序，得到堿基序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，菌株LDD3與已報道的多株假單胞菌屬（Pseudomonas）同源性達(dá)到99%以上，與施氏假單胞菌同源性達(dá)到100%，確定其為施氏假單胞菌，利用鄰接法通過MEGA.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

2.4 生長及耐鹽特性 LDD3在WB培養(yǎng)基和芘培養(yǎng)基中的生長曲線結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株LDD3在WB培養(yǎng)基條件下0～4h內(nèi)生長緩慢，4～16h生長較快，16h后達(dá)到穩(wěn)定生長期。在芘培養(yǎng)基中24～36h達(dá)到對數(shù)生長期，36～48h生長穩(wěn)定，84h后菌株開始衰亡。

不同NaCl濃度下菌株LDD3生長情況如圖4所示。由圖4可知，隨NaCl濃度的增加，LDD3的生長呈下降趨勢。在1%、3%NaCl濃度下生長的最好，5%NaCl濃度抑制菌株的生長，表明菌株LDD3最適生長鹽度范圍為1%～3%。

3 討論

PAHs微生物降解一直是國內(nèi)外研究的熱點，而微生物具有生長周期短、易于馴化培養(yǎng)、種類豐富等優(yōu)點，其在PAHs的生物修復(fù)、轉(zhuǎn)化及清除中具有良好的應(yīng)用前景。因此，篩選高效降解菌是修復(fù)PAHs污染環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。本研究通過選擇性富集培養(yǎng)法篩選7株具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌，在芘培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)及高效液相色譜儀測定，復(fù)篩得到高效降解芘的植物內(nèi)生菌LDD3，通過16S rDNA基因測序比對分析LDD3為施氏假單胞菌（Pseudomonas Schneider）。

LDD3具有溶解有機(jī)磷的能力，最適生長鹽度范圍為1%～3%，7d對芘降解率達(dá)到78%。王靜[8]等從天津港石油污染區(qū)篩選的B5具有良好的芘降解性能，在培養(yǎng)36h對芘（150mg/L）的總降解率高達(dá)96.3%。馮清敏[9]等篩選的Pseudomonas sp.M4，以原油為共代謝基質(zhì)時芘的降解率最高，30d降解率達(dá)61.23%。徐虹[10]等篩選的10號菌株在在混合反應(yīng)體系中培養(yǎng)30d后芘的降解率為80%，在只含一種PAH的單反應(yīng)體系中該菌對芘的降解能力則降低，降解率僅為62.47%。與混合PAHs培養(yǎng)體系相比，在單一PAHs培養(yǎng)體系中，細(xì)菌的對數(shù)生長期縮短1/3。環(huán)境中的PAHs多以混合物的形式存在，此前的研究發(fā)現(xiàn)，在生長培養(yǎng)基中添加額外的碳源可以提高細(xì)菌對芳香族化合物的降解效率[11]。共代謝是自然環(huán)境中重要的代謝機(jī)制[12]。大多數(shù)微生物無法利用多環(huán)芳烴作為唯一的碳源，但在其他低分子量營養(yǎng)物的存在下表現(xiàn)出降解能力[12]。共代謝作用是微生物降解多環(huán)芳烴的重要手段，馮清敏等[9]進(jìn)行了共代謝實驗，結(jié)果表明，相較于飽和烴和芳烴，以原油為共代謝基質(zhì)可增強(qiáng)其所篩選菌株M4對芘的共代謝作用。本研究采取芘作為唯一碳源培養(yǎng)基，未涉及其共代謝作用機(jī)制研究，下一步將研究多種PAH為碳源條件下LDD3的降解特性。

4 結(jié)論

從黃河三角洲重鹽堿原油污染地區(qū)健康生長的、蘆葦、稗草、鹽地堿蓬內(nèi)分離篩選出具有芘降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌7株，篩選得到的7株降解芘的植物內(nèi)生菌都具有溶解有機(jī)磷的能力。通過高效液相色譜儀測定菌株LDD3降解芘能力較強(qiáng)，7d對芘降解率達(dá)到78%。經(jīng)16S rDNA基因分子鑒定，LDD3為施氏假單胞菌。LDD3在WB培養(yǎng)基和芘培養(yǎng)基中的生長曲線，對數(shù)生長期為4～16h，耐鹽度范圍為1%～3%。通過對該菌促生和耐鹽特性的初步研究，為PAHs污染土壤的生物修復(fù)提供技術(shù)支撐。

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基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（2019GSF109036）;國家自然科學(xué)基金項目（41977124）;山東省高等學(xué)校青創(chuàng)科技支持計劃（2020KJD005）;山東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S201910449067）。

作者簡介：張?zhí)煊睿?001—），女，山東德州人，本科，研究方向：污染土壤生物修復(fù)。

通訊作者：吳濤（1980—），男，山東濟(jì)南人，博士，教授，研究方向：有機(jī)污染土壤修復(fù)。? 收稿日期：2021-12-21