程序性死亡配體1在肺癌組織中的表達(dá)及其與患者病理特征和疾病預(yù)后相關(guān)性研究

張軍艷，谷 俊

(1.銅川市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 銅川 727099；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，陜西 咸陽 712021)

肺癌為當(dāng)今全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位居首位的惡性腫瘤[1]，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升和低齡化的趨勢[2]。目前研究[3-4]普遍認(rèn)為，包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展并非一個(gè)局部的問題，而是涉及多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)和分子功能障礙的多因素、多階段的復(fù)雜過程。近年來，免疫療法及其相關(guān)的免疫逃逸機(jī)制已逐步成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[5]，程序性死亡配體1(Programmed death ligand-1,PD-L1)為目前臨床常見的免疫檢查點(diǎn)分子，其可通過抑制T淋巴細(xì)胞活化、負(fù)性調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。臨床研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)與肺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤的預(yù)后可能存在一定的相關(guān)性，但尚未有足夠證據(jù)證明其作為預(yù)測癌癥患者免疫治療預(yù)后的獨(dú)立生物學(xué)標(biāo)志物的可靠性。在抗腫瘤治療過程中，腫瘤的病理學(xué)特征往往對(duì)治療方案的選擇起到重要影響作用。因此，本研究通過收集我院部分肺癌患者的臨床資料和組織標(biāo)本，通過檢測組織中PD-L1的表達(dá)，旨在探究PD-L1的表達(dá)與肺癌患者病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集我院病理科于2015年1月至2017年3月期間行手術(shù)切除的原發(fā)性肺癌組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為肺癌；②術(shù)前未曾接受放化療或免疫治療；③病理組織無壞死區(qū)域。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；②臨床資料不完善。共90例標(biāo)本符合上述標(biāo)準(zhǔn)。另收集同期50例癌旁正常肺組織(距癌組織約2 cm)，并經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)無癌細(xì)胞浸潤，設(shè)為對(duì)照組。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要試劑：免疫染色固定液、免疫組化試劑盒(批號(hào)：P0098)；兔抗人PD-L1單克隆抗體(批號(hào)：ab230369)。

1.2.2 免疫組化法分析PD-L1的表達(dá)：將組織樣本置于中性甲醛中脫水固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3 μm厚，二甲苯脫蠟，分級(jí)乙醇水化，修復(fù)抗原，以3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，加一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗，室溫孵育60 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染，讀片，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，以上所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判讀 由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判讀，在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取5個(gè)視野，且單個(gè)視野內(nèi)癌細(xì)胞數(shù)量>200個(gè)，PD-L1以腫瘤細(xì)胞膜呈棕褐色或棕黃色而細(xì)胞核呈紅色顆粒為陽性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。以該例樣本5個(gè)視野中陽性細(xì)胞占比的平均值作為該例的表達(dá)率，另以所有病例的表達(dá)率的均數(shù)作為截?cái)嘀?，若某例樣本的表達(dá)率≥截?cái)嘀祫t定義該例樣本為陽性，反之則為陰性[9]。

1.4 隨 訪 所有患者均采取門診或電話的方式進(jìn)行為期5年的隨訪，以手術(shù)當(dāng)日未隨訪起始日期，以隨訪結(jié)束、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡為隨訪終點(diǎn)，失訪或其他原因死亡則視為刪失病例，計(jì)算無進(jìn)展生存期(Progression-free survival,PFS)和總生存期(Overall survival,OS)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組組織中PD-L1表達(dá)情況比較 肺癌組織中PD-L1的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，見表1。

表1 兩組組織中PD-L1表達(dá)情況比較[例 (%)]

2.2 PD-L1表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系 90例肺癌樣本中共有46例(51.11%)呈現(xiàn)PD-L1陽性表達(dá)，PD-L1陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的病例在不同性別、年齡、病理分類、吸煙史和表皮生長因子受體(EGFR)突變上比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，而在不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移上比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，見表2。

表2 PD-L1表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 在5年隨訪期中，90例病例中共失訪14例，死亡29例，存活47例。生存分析結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達(dá)患者的PFS和OS顯著短于陰性表達(dá)者(P=0.0008,P=0.006)，見圖1。

圖1 PD-L1表達(dá)與生存曲線

2.4 肺癌患者預(yù)后影響因素分析 以患者在隨訪結(jié)束時(shí)是否轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡作為因變量，將TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、PD-L1的表達(dá)作為自變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，TNM分期(β=0.558，P=0.009)、分化程度(β=1.423，P=0.019)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(β=0.269，P<0.001)和PD-L1(β=1.699，P<0.001)均為影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 肺癌患者預(yù)后多因素Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌為目前臨床最常見的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率及病死率增長迅速，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[10]。目前，肺癌的治療方案以外科手術(shù)切除、放化療以及免疫治療等為主[11]，盡管外科手術(shù)方式、放療技術(shù)均不斷進(jìn)步，靶向治療藥物亦推陳出新，然而多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)病變時(shí)往往已達(dá)中晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此治療后生存率仍較低，且仍有大量患者在根治術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[12]，收效甚微。因此，對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、免疫調(diào)控的研究已成為治療包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

近年來，隨著對(duì)腫瘤免疫療法及其相關(guān)的免疫逃逸機(jī)制的深入研究，抗腫瘤治療已由分子靶向治療階段進(jìn)入免疫治療的新階段，已有部分免疫治療藥物在臨床試驗(yàn)中展示出了較好的療效，為眾多中晚期惡性腫瘤患者帶來了新希望[13-14]。最新研究[15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可異常調(diào)節(jié)共刺激分子和表面抗原封閉。機(jī)體在正常狀態(tài)下，共刺激分子與負(fù)性共刺激分子處于動(dòng)態(tài)平衡之中，從而保持淋巴細(xì)胞的免疫效應(yīng)，在保證正常的免疫監(jiān)視和殺傷功能的同時(shí)又可避免自身免疫損傷，而腫瘤細(xì)胞被證實(shí)可刺激負(fù)性共刺激分子及其相關(guān)配體的表達(dá)，破壞正負(fù)信號(hào)平衡，破壞機(jī)體正常的免疫活性。既往研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1作為負(fù)性共刺激分子免疫球蛋白超家族中的重要一員，廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APCs)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞等中，可通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性，負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，參與包括細(xì)菌感染、病毒感染、腫瘤免疫逃逸、腫瘤細(xì)胞增殖及血管新生等在內(nèi)的多種生物學(xué)過程。PD-L1在肺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)研究[16-17]證實(shí)，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)PD-1的表達(dá)，大大增加其與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面PD-L1結(jié)合概率，從而進(jìn)一步激活PD-1/PD-L1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過高表達(dá)PD-1/PD-L1而募集細(xì)胞因子以及免疫抑制細(xì)胞，達(dá)到降低腫瘤細(xì)胞的抗原性作用，使免疫微環(huán)境由穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种茽顟B(tài)，而抑制腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷，腫瘤細(xì)胞通過上述“免疫編輯”過程，清除、均衡、逃逸，最終實(shí)現(xiàn)逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。

王平等[18]研究報(bào)道，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)患者體內(nèi)PD-L1呈現(xiàn)高表達(dá)，且與患者的臨床病理學(xué)特征及不良預(yù)后顯著相關(guān)，具有潛在的評(píng)估患者生存預(yù)后的價(jià)值。Petrova等[19]利用帕博利珠單抗治療非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)，發(fā)現(xiàn)阻斷了患者體內(nèi)的PD-1/PD-L1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時(shí)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)明顯恢復(fù)，腫瘤生長顯著抑制，患者生存期得以顯著延長。本研究中，肺癌組織中PD-L1的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，提示PD-L1可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。然而，PD-L1的表達(dá)與肺癌病理學(xué)特征及患者預(yù)后是否存在關(guān)聯(lián)，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步分析肺癌患者的臨床病理學(xué)資料，發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)在不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移上有顯著差異；生存曲線分析結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達(dá)患者的PFS和OS顯著短于陰性表達(dá)者，提示PD-L1的表達(dá)與肺癌患者的病理學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān)。此外，本研究還分析了影響肺癌患者預(yù)后的因素，Logistic回歸分析結(jié)果表明，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和PD-L1的表達(dá)均為影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。鄭文[20]報(bào)道稱，非小細(xì)胞肺癌患者在接受125I粒子治療后PD-1和PD-L1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降，預(yù)后顯著改善，其機(jī)制可能與抑制PD-1/PD-L1通路而抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。

綜上所述，本研究表明PD-L1的表達(dá)與肺癌患者病理學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān)，具有一定的臨床預(yù)測價(jià)值，同時(shí)有望成為臨床治療肺癌的新靶標(biāo)。