BnaTT2基因缺失黃籽甘藍型油菜材料的創(chuàng)制

安 然，張彥鋒，陳娜娜，韋世豪，朱彥濤，穆建新

(陜西省雜交油菜研究中心，陜西 楊凌 712100)

油菜是我國第一大油料作物，也是多種輪作倒茬作物模式中不可缺少的作物，對我國的食用油供給安全和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1]。甘藍型油菜是我國油菜的主要栽培品種，對其品質(zhì)進行改良，是促進我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。從營養(yǎng)價值來看，不同種皮顏色的甘藍型油菜籽營養(yǎng)成分存在差異。有研究表明，在相同的遺傳背景條件下，與黑籽油菜品種相比，黃籽油菜的含油量、蛋白質(zhì)含量較高[2]，硫代、芥酸等抗營養(yǎng)物質(zhì)以及木質(zhì)素和多酚的含量較低[3-4]。從生產(chǎn)方面來看，黃籽油菜的皮殼率低，出油率高，油色清亮，并且對菜籽油的產(chǎn)量提升也有一定的促進作用[5-7]。因此，黃籽油菜品種的創(chuàng)制對油菜生產(chǎn)和育種有著重要意義[8-9]。

黃籽甘藍型油菜種質(zhì)資源多樣，但不存在天然的黃籽油菜材料，所以其遺傳機理解析相對復(fù)雜[8]。1960年首個黃籽甘藍型油菜被發(fā)現(xiàn)，之后研究者發(fā)現(xiàn)油菜種皮黑色素積累與類黃酮變化存在一定的相關(guān)性[10-15]。而作為類黃酮代謝途徑中重要分支的原花色素，也被證實是調(diào)控種皮顏色的重要物質(zhì)[16-17]。根據(jù)已知的十字花科類黃酮代謝途徑，BnaTT2基因調(diào)控的4-二氫黃酮醇還原酶(DFR)、TT8基因調(diào)控的花色素還原酶等都是類黃酮合成途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子[18-19]。因此，對這些基因的研究和利用是黃籽油菜品種選育的關(guān)鍵所在。

DFR能夠使二氫榭皮素生成無色花色素，進而產(chǎn)生色素積累，形成深色油菜籽粒[20]。因此抑制DFR基因的表達是種皮顏色顯黃的關(guān)鍵。甘藍型油菜共有2個BnaTT2基因，分別位于甘藍型油菜的A08和C08兩條染色體上，均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。相關(guān)研究證明，BnaTT2基因能夠有效調(diào)控DFR基因的表達[18]。因此，對BnaTT2基因進行研究與靶向敲除，是獲得黃籽油菜材料的重要環(huán)節(jié)。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRIS-PR associated nuclease 9)基因編輯技術(shù)是一種新興的基因編輯技術(shù)，可以實現(xiàn)對靶向基因的精準敲除、序列替換和定點突變，快速創(chuàng)制目標突變體，已經(jīng)逐步成為作物種質(zhì)資源創(chuàng)制的重要手段之一，該技術(shù)在基因功能研究方面已逐漸成熟并成功應(yīng)用于多種動植物。目前，植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)已日臻完善，在擬南芥以及煙草、水稻、高粱、小麥、玉米等農(nóng)作物中都已成功應(yīng)用[21-25]。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)，對甘藍型油菜類黃酮合成途徑的關(guān)鍵基因BnaTT2進行靶向敲除，以創(chuàng)制BnaTT2基因突變體材料，并最終獲得了黃籽的甘藍型油菜材料，可為甘藍型油菜育種提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍型油菜(BrassicanapusL．，2n=38，AACC)受體材料K407、大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞、根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞等，均由陜西省雜交油菜研究中心油菜分子設(shè)計育種實驗室提供；CRISPR/Cas9基因編輯載體pHSE401，由中國農(nóng)業(yè)大學陳其軍教授提供。引物合成及DNA測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1BnaTT2基因敲除靶位點序列設(shè)計 利用CRISPR/Cas9 在線靶位點設(shè)計網(wǎng)站(CRISPR RGET Tool)、油菜數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/index.php)以及NCBI提供的序列信息，對甘藍型油菜基因BnaTT2進行序列比對，在不同拷貝的BnaTT2同源編碼區(qū)上尋找包含CRISPR/Cas9系統(tǒng)可識別的共同靶位點核苷酸序列，設(shè)計靶位點，合成靶位點序列用于基因編輯，靶位點引物序列為17-TT2-P1(5′-ATTGTGTTCCACGGCGAAGGA-AAA-3′)和17-TT2-P2(5′-AAACTTTTCCTTCG-CCGTGGAACA-3′)。

1.2.2 載體的構(gòu)建 構(gòu)建載體參考Wang等[26]的方法。以甘藍型油菜DNA為模板，利用引物17-TT2-P1/17-TT2-P2進行PCR擴增。PCR擴增程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系20 μL：DNA模板2 μL，引物各0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。將擴增片段連入CRISPR/Cas9載體pHSE401上，命名為pHSE401-TT2。測序檢測后，利用電擊法將pHSE401-TT2轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，測序檢測后將其命名為GV3101-TT2。

1.2.3 甘藍型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對甘藍型油菜下胚軸進行遺傳轉(zhuǎn)化[27]。甘藍型油菜種子經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇消毒1 min后，再用體積分數(shù)15%次氯酸鈉(含吐溫200 μL)消毒15 min，并用ddH2O漂洗。點播于1/2 MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)7 d。切取油菜下胚軸約10 mm作為外植體，使用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 GV3101-TT2菌液(OD為0.4～0.6)侵染10 min，再用M1培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+1 mg/mL 2,4-D溶液1 mL)共培養(yǎng)2 d，然后依次轉(zhuǎn)入M2培養(yǎng)基(M1培養(yǎng)基+50 mg/mL潮霉素溶液50 μL)、M3培養(yǎng)基(M2培養(yǎng)基+0.1 mg/mL吲哚乙酸溶液250 μL)中繼續(xù)培養(yǎng)，待產(chǎn)生幼芽后，切取芽體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基M4(M1培養(yǎng)基+0.1 mg/mL α-萘乙酸溶液100 μL)中生根，生根后移栽至含基質(zhì)的土壤中煉苗，最后轉(zhuǎn)至人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng)，直至收獲種子。

1.2.4 陽性植株鑒定 將遺傳轉(zhuǎn)化后的幼苗(T0代)移栽至土壤中，用堿裂解法(SDS法)提取幼嫩葉片DNA，用載體骨架序列特異性擴增引物U6-F/CRIS-R(表1)進行靶位點PCR檢測。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系20 μL：DNA模板2 μL，引物各0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。連接、轉(zhuǎn)化后挑取單克隆送檢測序，篩選出含有載體骨架序列的植株。

1.2.5 陽性株系變異位點檢測 根據(jù)油菜數(shù)據(jù)庫提供的基因序列信息，針對甘藍型油菜BnaTT2基因在所檢測到的靶位點側(cè)翼設(shè)計特異引物F2/R2(表1)，對含有載體骨架序列的植株進行靶位點序列擴增，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系20 μL：DNA模板2 μL，引物各0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。對目標片段進行克隆和測序分析，解析BnaTT2基因的突變位點。

1.2.6 T1和T2代植株靶位點的檢測 將利用CRI-SPR/Cas9獲得的BnaTT2基因突變體植株(T0代)自交套袋后收獲種子(T1代)，從中選取黃色籽粒T1代種子進行種植。在苗期提取幼嫩葉片DNA，用引物F2/R2(表1)進行靶位點PCR檢測，PCR擴增程序和體系與1.2.5節(jié)同。對發(fā)生靶位點突變的T1代植株套袋自交并收獲種子(T2代)，選擇黃色籽粒的T2代種子繼續(xù)種植。苗期提取葉片DNA后用引物F2/R2(表1)進行靶位點PCR檢測，PCR擴增程序和體系與1.2.5節(jié)同，驗證靶位點突變情況。

表1 CRISPR/Cas9敲除基因位點檢測所用的引物

1.2.7 油菜籽粒生物學特性分析 利用SLY-C微電腦自動數(shù)粒儀和LT1002B電子天平測定油菜籽粒的千粒質(zhì)量，測3次后取平均值。黃籽粒色觀測按照便于量化的原則，采用李加納等[28]的6 級標準，肉眼觀察確定種子顏色等級(color index，CI)。單顆籽粒中，黃色部分占總籽粒面積≥80%為5級，≥60%～<80%為4級，≥40%～<60%為3級，≥20%～<40%為2級，<20%為1級，完全褐籽或黑籽為0級。利用公式CI=∑(等級數(shù)×該等級籽粒數(shù)占所有等級籽粒數(shù)的百分比)計算單株的平均顏色等級。利用近紅外光譜分析儀(BURKER MATRIX-I)測定T2代黃色油菜籽粒的脂肪酸成分和含油量，計算各組分相對含量，以K407材料為對照，利用SPSS Statistics 26進行t檢驗比較二者的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型油菜目的基因靶標片段的選擇與構(gòu)建

從供試甘藍型油菜中擴增BnaTT2基因序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的同序列進行比對，發(fā)現(xiàn)BnaTT2基因在甘藍型油菜中有2個拷貝。利用在線設(shè)計軟件(CRISPR RGET Tool)，在BnaTT2基因第1個外顯子上選擇2個拷貝的共有序列為靶位點序列，構(gòu)建BnaTT2基因編輯載體，具體靶位點序列見圖1。

圖1 甘藍型油菜BnaTT2基因的靶位點序列

2.2 甘藍型油菜基因編輯植株的鑒定與分析

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對甘藍型油菜下胚軸進行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得T0代植株16株，提取對照材料K407和T0代植株的DNA，利用載體引物U6-F/CRIS-R和靶位點側(cè)翼設(shè)計特異引物F2/R2對其進行PCR檢測，有4株T0代植株靶位點發(fā)生了突變。對4株T0代植株套袋自交后收獲油菜籽粒(T1代)。T1代黃色籽粒油菜植株種植后利用引物F2/R2進行PCR檢測發(fā)現(xiàn)， 有6株植株存在位點突變(存在雜合體植株)，套袋自交收獲T2代油菜籽粒。T2代黃色籽粒種子種植后進行PCR驗證，最終確定有2株能夠穩(wěn)定遺傳的純合體BnaTT2基因突變體植株(TT2-Mutant-1和TT2-Mutant-2)，其堿基突變位點見圖2。圖2表明，TT2-Mutant-1突變體在靶位點存在單堿基A的插入，TT2-Mutant-2突變體則是在靶位點存在單堿基A的缺失。

□.堿基插入位點；│.堿基缺失位點.CK.對照材料K407；TT2-Mutant.BnaTT2基因缺失T2代材料；圖3同

2.3 油菜籽粒的生物學特性

2.3.1 千粒質(zhì)量及粒色 經(jīng)測定，TT2-Mutant和K407的千粒質(zhì)量分別為4.74和3.62 g，TT2-Mutant的千粒質(zhì)量較對照K407增加了1.12 g。黃色油菜籽粒的黃色度等級為4.8。籽粒顏色和籽粒大小對比如圖3所示，每行40粒種子，基因編輯材料TT2-Mutant油菜籽粒與對照K407相比明顯變大，種皮顏色由黑色(K407)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，這表明BnaTT2基因的靶向敲除能夠引起油菜籽粒顏色的改變。

圖3 甘藍型油菜突變體籽粒顏色和籽粒大小的變化

2.3.2 脂肪酸成分 T2代油菜籽粒的脂肪酸成分測定結(jié)果(圖4)顯示，TT2-Mutant材料各組分相對含量分別為：油酸(56.08±0.17)%，亞油酸(21.49±0.31)%，亞麻酸(12.73±0.17)%,芥酸(0.92±0.23)%；含油量(47.25±0.16)%。相比對照K407，黃籽油菜籽粒的含油量、亞油酸和亞麻酸相對含量分別提升6.10%，3.13%和4.99%；而芥酸及油酸相對含量則分別下降1.53%和1.01%。t檢驗結(jié)果顯示，與對照材料K407相比，黃籽油菜籽粒油酸相對含量存在顯著差異(P<0.05)，而亞油酸、亞麻酸、芥酸相對含量和含油量存在極顯著差異(P<0.001)，表明對BnaTT2基因的靶向敲除一定程度上影響了油菜籽粒的脂肪酸組分。

*.P<0.05；***.P<0.001；TT2-Mutant均為2株突變體(TT2-Mutant-1和TT2-Mutant-2)的平均值

3 討論與結(jié)論

油菜作為我國主要的油料作物，其含油量高低、油分品質(zhì)優(yōu)劣對我國的油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展有至關(guān)重要的作用。較黑籽油菜而言，黃籽油菜有著高含油量、高蛋白含量、低硫苷、低芥酸等優(yōu)點，因此對其相關(guān)功能基因進行研究，對油菜品質(zhì)改良具有重要的理論與實踐意義。

基因敲除技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得基因功能研究簡單易行。而CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)能夠誘導(dǎo)基因組雙鍵斷裂，并通過細胞自身的非同源末端重組修復(fù)途徑造成若干堿基的插入、缺失和替換，從而使基因發(fā)生移碼突變，起到基因敲除的作用。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對甘藍型油菜的BnaTT2基因進行靶向敲除，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得2株黃籽油菜籽粒材料(TT2-Mutant-1和TT2-Mutant-2)，對其BnaTT2基因靶位點進行測序分析顯示，TT2-Mutant-1和TT2-Mutant-2在BnaTT2基因的2個拷貝上都存在單堿基插入或缺失，其中TT2-Mutant-1突變體在BnaTT2基因靶位點上存在單堿基A的插入，TT2-Mutant-2突變體則是單堿基A缺失。以上結(jié)果表明，本試驗所構(gòu)建的基因編輯載體能夠準確地對BnaTT2基因進行靶向編輯，使該基因相關(guān)位點發(fā)生堿基突變；同時該堿基位點的突變能夠影響B(tài)naTT2基因的功能表達，使油菜籽粒的種皮顏色由黑色(基因編輯前)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色(基因編輯后)，說明BnaTT2基因與油菜籽粒的種皮顏色密切相關(guān)。此外，BnaTT2基因靶向敲除材料TT2-Mutant的千粒質(zhì)量相較對照增加了1.12 g，千粒質(zhì)量的變化可能與BnaTT2基因的靶向敲除有關(guān)，也可能由其他原因引起，該部分變化原因有待進一步分析驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照K407相比，TT2-Mutant的脂肪酸組分相對含量發(fā)生了很大變化，其中含油量極顯著提升了6.10%，表明BnaTT2基因功能缺失能夠在一定程度上影響油菜籽粒的油脂相對含量，進而影響油菜的出油量；同時，BnaTT2基因的功能缺失還導(dǎo)致TT2-Mutant中的芥酸相對含量極顯著下降1.53%，而亞油酸及亞麻酸相對含量分別極顯著提升3.13%和4.99%，這表明BnaTT2基因功能缺失能夠影響籽粒中脂肪酸的組成，可以有效提高對人體有益的脂肪酸含量，降低有害物質(zhì)含量，可為優(yōu)質(zhì)精品食用油的創(chuàng)制提供新途徑，為甘藍型油菜育種提供新的種質(zhì)資源。