強精煎介導PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控少精子癥大鼠精子發(fā)生的實驗研究

陸海旺，賓彬，林思偉，王德勝，王杰，藍艷梅

（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

近年來，男性不育癥的發(fā)生率逐漸升高，嚴重影響患者家庭和諧，少精子癥是男性不育癥常見的臨床表現(xiàn)，是指男性精子濃度＜15×106/mL 或一次射精的精子總數(shù)＜39×106（需嚴格禁欲2～7 d，且優(yōu)先考慮精子總數(shù)）。少精子癥的發(fā)生，常由于睪丸發(fā)育障礙、生精細胞功能缺陷，或由于輸精管不完全梗阻、炎癥、感染等多方面因素引發(fā)，也有較大比例原因不明的少精子癥，即特發(fā)性少精子癥，可能涉及內(nèi)分泌、基因、染色體和免疫等多方面與生精功能密切相關的環(huán)節(jié)，需進一步深入探討和闡明其機理。現(xiàn)代醫(yī)學尚缺乏針對特發(fā)性少精子癥療效確切的藥物，更多停留在經(jīng)驗性治療階段，常用手段有抗氧化、抗雌激素、補充微量元素等，大多療效不確切或存在爭議。輔助生殖技術雖然解決了眾多患者的生育問題，但并沒有從病因上去干預，本質(zhì)上是繞開病因的一種手段。輔助生殖技術還存在倫理爭議、成本高昂、成功率令人不甚滿意、對女方潛在的各種損害等缺陷。通過治療改善精子質(zhì)量而實現(xiàn)自然生育，仍然是臨床醫(yī)師和患者共同追求的愿望，也更符合優(yōu)生優(yōu)育的要求。中醫(yī)藥治療男性不育歷史悠久，經(jīng)驗豐富，療效獨特，優(yōu)勢顯著，但其作用機理尚未完全闡明。強精煎為筆者多年來用于治療少、弱精子癥的經(jīng)驗方，具有健脾益腎、清熱利濕活血的功效，前期實驗和臨床研究已證實［1］，強精煎可通過抗氧化［2］和抗生精細胞凋亡［3］等多方面作用，有效改善精子數(shù)量和活力。

近年有研究表明PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路可調(diào)控生精細胞增殖、分化和精子發(fā)生，對少精子癥的轉歸起到關鍵的調(diào)節(jié)作用［4］。中醫(yī)藥通過調(diào)控以上通路，以干預精子發(fā)生，改善少精子癥，增加精子數(shù)量的相關報道比較少見，研究大多僅涉及通路的一部分。本研究采用環(huán)磷酰胺（CTX）誘導大鼠少精子癥模型，探討強精煎對少精子癥模型大鼠的治療作用及其對PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游通路（p70S6 K/4EBP1）的調(diào)控作用，以進一步揭示強精煎治療少精子癥的分子生物學機制，豐富中醫(yī)藥治療少精子癥的理論依據(jù)和內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源與分組

清潔級雄性SD 大鼠75 只，購自長沙天勤生物技術公司，8～10 周齡，體質(zhì)量（250 ± 10）g，動物許可證號：SCXK（湘）2014－0011。本項目實驗已經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會審查備案通過。大鼠隨機分為空白對照組、模型組、mTOR 通路抑制劑組（雷帕霉素組）和強精煎+雷帕霉素組和強精煎組，每組15只。

1.1.2 主要試劑、儀器及藥物

各免疫組化一抗試劑盒（PI3K：sc－376112、Akt：sc－377457、mTOR：ab32028、p70S6K：sc－8418、4EBP1：sc－9977、Ki－67：ab15580，均采購于Santa Cruz 公司）；免疫組化二抗試劑盒（貨號：SP0041，北京索萊寶公司）；PCR 試劑盒（貨號：RR047A）、引物均由寶生物公司提供。

ASP300S 全自動組織脫水機、ST5020 多功能染色機、DM3000 生物顯微鏡、圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國Leica公司）；LightCycler?480實時熒光定量PCR 儀（羅氏公司）；Mastercycle Nexus PCR循環(huán)儀（eppendoff公司）。

強精煎（當歸10 g，枸杞子20 g，黃芪30 g，益母草30 g，鹿角霜15 g，五味子10 g，續(xù)斷20 g，黨參15 g，生牡蠣30 g，神曲10 g，菟絲子20 g和紫河車10 g）由天江藥業(yè)有限公司提供（機配免煎）；環(huán)磷酰胺凍干粉（Baxter Oncology GmbH 公司，批號：0C371A）；雷帕霉素（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11542563）。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥

預實驗參考其他文獻［5］采用大劑量（50 mg）環(huán)磷酰胺短期（5 d）連續(xù)腹腔注射誘導少精子癥大鼠模型，成模率不理想且病死率過高，實驗的可靠性有限，筆者經(jīng)反復嘗試后證實，采用較低劑量20 mg/（kg·d）環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注射給藥，連續(xù)14 d可獲得穩(wěn)定可靠的少精子癥大鼠模型，造模病死率相對較低，經(jīng)長期（8周）觀察，睪丸仍處于萎縮－低生精狀態(tài)，彌補了生精功能自然恢復導致的數(shù)據(jù)不可靠的缺陷。見圖1。

根據(jù)徐淑云主編的《藥理實驗方法學》，使用基于人和大鼠之間的體表面積轉換的等效劑量比，計算出大鼠的等效劑量。測算后強精煎高劑量（等效劑量4 倍）為12 g/（kg·d），前期研究已證實該給藥劑量可顯著增加少精子癥大鼠的精子數(shù)量和活動力［6］。造模成功后，雷帕霉素組給予雷帕霉素2 mg/（kg·d）腹腔注射［7］；強精煎+雷帕霉素組在雷帕霉素組基礎上給予強精煎配方顆粒12 g/（kg·d）灌胃；強精煎組給予強精煎配方顆粒12 g/（kg·d）灌胃；空白對照組和模型組大鼠每天給予生理鹽水灌胃。每周復測大鼠體質(zhì)量作為動態(tài)調(diào)整給藥劑量的依據(jù)。連續(xù)給藥38 d，足1個大鼠生精周期［8］。

1.2.2 標本采集與制備

于末次給藥24 h后，以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉各組大鼠，剪開腹腔，將雙側睪丸拖出，去除附睪、脂肪等組織，完整分離睪丸，吸干血跡，一側睪丸迅速置于-80 ℃超低溫冰箱中待測，剩余睪丸組織放入10%濃度的甲醛溶液中，4 ℃冷藏24 h固定，待下一步操作。

1.2.3 采用IHC（免疫組化）法檢測Ki－67、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1蛋白表達

樣品處理按IHC 試劑盒要求進行，基本步驟有脫蠟－修復－封閉－加抗體－染細胞核－脫水封片等。對每個樣本，在顯微鏡200 倍條件下隨機采集5 個視野，每個視野用IPP 進行陽性總面積、平均光密度和總光密度（IOD）測量，并統(tǒng)計分析各組總光密度（IOD）差異。

1.2.4 RT－PCT 檢 測PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達

采用Trizol 法提取RNA：將大約50 mg 的睪丸組織加入到Trizol EP管中勻漿，轉到無RNase EP管中裂解。加入氯仿，低溫高速離心15 min。轉移到新的EP管，加異丙醇混勻。低溫高速離心獲得RNA 沉淀。去掉上清，加去酶75%乙醇，混勻，低溫離心。去掉上清，將沉淀空氣干燥，其后以DEPC 水溶解，吸取該溶解液1 μL以DEPC水稀釋，用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。逆轉錄：①去除DNA 反應條件為42 ℃2 min；②4 ℃逆轉錄，反應條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min。引物序列見表1。實時熒光定量PCR檢測（TB GreenTM Premix ExTaqTM Ⅱ：RR820 A）部分樣本的cDNA 做10 倍稀釋，反應條件：95 ℃30 s，1 cycle；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 cycles。繪制溶解曲線。實驗檢測過程中，進行3個重復孔實驗設計，最后結果2－△△Ct進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結果要求3個重復孔間CP、Tm數(shù)值相差在±0.5之間，以保證實驗操作穩(wěn)定，重復性好。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表達，組間比較采用單因素方差分析，事后組間多重比較采用LSD－t檢驗（即主要進行有專業(yè)意義的組間比較），檢驗水準α= 0.05，以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67蛋白表達水平比較

與空白對照組對比，模型組和雷帕霉素組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67蛋白表達水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，雷帕霉素組mTOR蛋白表達水平降低更為顯著（P＜0.01）；與模型組比較，強精煎+雷帕霉素組、強精煎組mTOR、PI3K、Akt、p70S6K、Ki－67、4EBP1 蛋白表達水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，從免疫組化切片也可以看出，空白對照組大鼠睪丸生精上皮結構完整，生精細胞連接緊密，精子密集分布填充于管腔，提示生精活躍；而模型組大鼠睪丸組織生精上皮結構明顯破壞，生精細胞層次不完整，精子數(shù)量銳減現(xiàn)象普遍存在，提示生精功能受到明顯抑制；雷帕霉素組生精細胞減少和缺失等病理損傷現(xiàn)象尤為明顯，精子數(shù)量更少；經(jīng)干預后，強精煎+雷帕霉素組、強精煎組大鼠睪丸組織生精上皮病理損傷得到明顯修復，生精細胞層次較為完整，生精較為活躍，提示在強精煎干預下，大鼠損傷的生精功能已得到明顯改善。見圖2～圖7。

圖2 各組大鼠睪丸組織PI3K蛋白表達比較

圖3 各組大鼠睪丸組織Akt蛋白表達比較

圖4 各組大鼠睪丸組織mTOR蛋白表達比較

圖5 各組大鼠睪丸組織4EBP1蛋白表達比較

圖6 各組大鼠睪丸組織p70S6K蛋白表達比較

圖7 各組大鼠睪丸組織Ki－67蛋白表達比較

2.2 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達比較

與空白對照組對比，模型組和雷帕霉素組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，雷帕霉素組表達水平降低更為顯著（P＜0.01）；與模型組、雷帕霉素組相比，強精煎+雷帕霉素組、強精煎組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可見，以上基因表達趨勢與免疫組化蛋白表達結果是基本相同的。見圖8。

圖8 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達比較

3 討論

除梗阻因素等特殊情況外，精子數(shù)量主要取決于精子發(fā)生的活躍程度。精子發(fā)生是指從精原細胞到形成精子的過程?；具^程包括精原細胞分裂增殖成精母細胞、精母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體的精子細胞、精子細胞變態(tài)形成精子這三個階段［9］，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)停滯和障礙，都將影響最后的精子數(shù)目，可以說是少精子癥發(fā)生的根本原因。少精子癥與睪丸組織基因表達異?；蛐盘杺鲗М惓Ｋ碌纳系K關系密切。其中，精原細胞分裂增殖是精子發(fā)生數(shù)量的基礎，復雜的基因和蛋白網(wǎng)絡調(diào)控著這一細胞增殖進程，其中信號因子和信號通路有著突出作用［9］，這也是近年來有關生精細胞增殖和精子發(fā)生的研究熱點。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K 信號轉導通路是調(diào)控細胞增殖的重要轉導通路之一［10］，該信號通路在細胞的生長、增殖、分化和存活中扮演中心調(diào)控角色［11］。細胞信號分子與細胞膜受體及受體底物結合后，能夠激活RTK/P13K/Akt 及其下游mTOR 信號級聯(lián)［12－13］，抑制PI3K/Akt/mTOR則可誘導細胞周期停滯和細胞凋亡［14］。

雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是Akt 的重要底物之一，屬于磷酸肌醇相關激酶家族成員，是一種重要的信號傳導分子［9］，是細胞代謝的中樞調(diào)節(jié)器之一［15］，能夠調(diào)控細胞增殖、分化、細胞周期、能量代謝等細胞活動。PI3K/Akt 信號通路通過調(diào)節(jié)mTOR 信號及其下游靶因子p70S6K/4EBP1 的表達，進而影響靶細胞或靶器官的結構和功能［16－19］。精原干細胞和精母細胞均有mTOR、p70S6 K、4EBP1 及相應磷酸化蛋白（p－mTOR、p－p70S6K、p－4EBP1）的 表 達［4］，且mTOR 信號對早期生精細胞和精原干細胞表型維持及分化有重要作用［20］。抑制mTORC1 通路可阻斷精原細胞的分化，誘導未分化精原細胞在生精小管中的積聚，并阻斷睪丸組織中編碼酪氨酸激酶受體ckit（kit）基因的翻譯［21］，精原細胞p70S6K 磷酸化水平也受其調(diào)控。雷帕霉素可抑制睪丸中mTOR 蛋白的表達，抑制睪丸精原細胞的增殖和分化。同時，mTOR 蛋白下游的p－p70S6K 和p－4EBP1 表達降低，維甲酸8 激活基因的表達也受到抑制，而維甲酸8是啟動減數(shù)分裂的關鍵基因［20］，抑制p70S6K/4EBP1信號可能導致哺乳動物睪丸毒性，如生精小管退化和生精細胞數(shù)量減少［7］。mTOR、p－p70S6K 和p－4EBP1在大鼠睪丸組織中的表達隨著大鼠年齡增長而降低，這表明mTOR 及其下游通路p70S6K/4EBP1 參與調(diào)節(jié)精原細胞增殖及其向精子的分化［7］。綜上所述，以上通路控制了生精細胞的產(chǎn)生和增殖，最終影響精子數(shù)量。

雷帕霉素類似物治療可影響精原細胞分化增殖，同時抑制下丘腦－垂體－性腺軸，干擾生殖內(nèi)分泌。使用雷帕霉素治療腫瘤或腎臟移植后免疫抑制反應的過程中，可導致男性患者生精功能障礙，表現(xiàn)為少精子癥、無精子癥［22］。動物實驗也表明，雷帕霉素可導致大鼠睪丸萎縮、生精上皮空泡化、曲細精管管腔萎縮稀疏、生精細胞層數(shù)減少甚至缺如、腔內(nèi)精子減少或無精子、間質(zhì)細胞增生等［23］。Ki－67 作為細胞增殖相關的核抗原，其表達水平與細胞增殖活躍度呈正相關，常用作評估細胞增殖程度的標記物［24］。

國醫(yī)大師王琦認為“腎虛夾濕、熱、瘀、毒、蟲”是少、弱精子癥的根本病機［25］。筆者以為，治療少、弱精子癥，應先天、后天并重，生精、強精當脾腎氣血并調(diào)，在補腎生精的同時，注重兼顧脾胃后天之本，增強脾胃運化水谷精微的能力，使得生精有源，切勿“徒補其腎”。強精煎方中黨參健脾益氣，菟絲子、枸杞子“以子補子”，共為君藥。黃芪－當歸藥對實為當歸補血湯，功能益氣補血養(yǎng)血；續(xù)斷補肝腎、壯腰膝，精不足者補之以味，紫河車、鹿角霜助君藥生精，共為臣藥。益母草清熱活血散瘀，五味子“益男子精”，生牡蠣潛陽固精，共為佐藥。六神曲健脾和胃為使藥，諸藥合用共奏健脾益腎、清熱散瘀、生精強精之效。強精煎的前期臨床研究提示，該方可明顯改善少、弱精子癥患者的精子數(shù)量和活力，實驗研究發(fā)現(xiàn)該方有抗氧化、抗生精細胞凋亡等作用，但對其調(diào)控精子發(fā)生的作用尚未深入探討。本研究在對重度少精子癥大鼠模型進行強精煎干預后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)中藥強精煎干預的兩組大鼠睪丸萎縮現(xiàn)象得到改善，睪丸生精上皮得到較好的修復，精子數(shù)量上升，表明強精煎可拮抗生精上皮病理損傷，促進少精子癥大鼠精子發(fā)生，改善睪丸低生精狀態(tài)。

本研究結果顯示，模型組大鼠睪丸組織中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67 蛋白表達均低于空白對照組，提示模型組大鼠睪丸生精受損與PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游靶因子（p70S6K、4EBP1）、細胞增殖標記蛋白Ki－67 表達受到抑制，生精細胞增殖分化減弱有關。給予mTOR 通路抑制劑雷帕霉素后，雷帕霉素組大鼠mTOR 蛋白及基因表達降低尤為明顯，下游靶因子p70S6K、4EBP1 表達亦顯著下調(diào)，睪丸病理損傷最為嚴重，這提示mTOR 通路被抑制后，大鼠睪丸生精發(fā)生明顯受阻。給予強精煎干預后的兩組大鼠PI3K、Akt、mTOR 通路蛋白，下游靶蛋白p70S6K、4EBP1，Ki－67 蛋白表達均顯著上調(diào)，同時PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達水平也顯著上調(diào)，提示強精煎改善少精子癥大鼠模型生精作用可能是通過激活PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游靶基因/蛋白表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，強精煎可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及其下游靶基因/蛋白（p70S6 K、4EBP1）以及細胞增殖標記蛋白Ki－67 的表達，改善少精子癥大鼠的生精功能，修復睪丸病理損傷，促進精子發(fā)生，增加精子數(shù)量。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1 通路調(diào)控精子發(fā)生作用機制較為復雜，而且強精煎為復方中藥制劑，其發(fā)揮治療作用的具體有效成分和更精細的機制尚有待深一步研究探索。