基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討青蒿改善心腎毒性的潛在作用機制

廖奕嬌，鄒凌，何日明，易鐵鋼?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院，廣東 惠州 516001）

惡性腫瘤至今仍是發(fā)達(dá)國家的第一大致死原因，是發(fā)展中國家第二大致死原因［1］。癌癥的發(fā)病率及病死率在我國呈上升趨勢，給我國的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)帶來巨大壓力，極大降低了癌患的生活質(zhì)量。目前，常見的化療藥物有鉑劑類、抗腫瘤抗生素類、生物堿類、代謝類藥物和烷基化藥物等，但抗癌藥物毒副作用嚴(yán)重限制了其臨床療效。細(xì)胞毒性化療藥物雖為常見的癌癥治療手段，然而其臨床用藥的劑量受藥物的耐藥性和毒副作用限制?？拱┧幬锍Ｒ姷亩靖弊饔糜心I毒性、心臟毒性、胃腸毒性、周圍神經(jīng)病變和骨髓抑制等［2］。毒副作用的嚴(yán)重程度又與抗癌藥物的類型、給藥劑量和途徑密切相關(guān)。抗癌治療出現(xiàn)心腎毒性可導(dǎo)致癌癥患者病死率增加，特別是既往有心臟病和/或腎臟病史的病患［3］?；熕幬锏亩靖弊饔贸Ｆ仁菇o藥劑量降低，在出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的情況下，還往往被迫中斷治療，導(dǎo)致病情的惡化。

由于抗癌藥物的毒副作用發(fā)病機制復(fù)雜，臨床上尚無有效治療藥物可減少毒副作用的發(fā)生。近年來中藥、中藥提取物等作為治療放化療不良并發(fā)癥的新興方法已取得一定療效，受到了廣泛關(guān)注。中醫(yī)藥可以通過不同的作用機制減少抗腫瘤藥物的毒副作用，如抗氧化、抑制凋亡、減少炎癥因子，以及改善臨床癥狀、提高免疫力等，從而防止藥物毒性對正常細(xì)胞的損害［1，4］。研究發(fā)現(xiàn)青蒿及其衍生物具有一定的抗腫瘤作用，然而對其抗腫瘤療效的研究大多側(cè)重于耐藥性方面［5］，青蒿對抗癌藥物的心腎毒副作用是否具有減輕作用卻鮮有報道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合性學(xué)科，可通過構(gòu)建藥物與疾病的靶標(biāo)分子網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測藥物對疾病的潛在通路及作用機制，對闡明中醫(yī)藥的療效機制具有極大的作用。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對青蒿改善心腎毒性的有效成分及靶點進(jìn)行分析，以探討其減輕心腎毒性的潛在機制，為中醫(yī)藥治療心腎毒性相關(guān)疾病提供參考。

1 資料與方法

1.1 青蒿的活性成分及靶點篩選

通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP）［6］對青蒿的組成成分進(jìn)行檢索，并篩選其活性成分及蛋白靶點，標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，并查閱文獻(xiàn)對青蒿的成分靶點進(jìn)行補充。將篩選出的蛋白靶點通過Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）對其名稱進(jìn)行規(guī)范化處理和整合。

1.2 構(gòu)建青蒿“活性成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建青蒿的“活性成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，通過“節(jié)點”（node）和“邊”（edge）將活性成分與靶點關(guān)系可視化。通過對青蒿的成分靶點進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)運算，得到連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等數(shù)值，以分析藥物的核心靶點和關(guān)鍵的活性成分。

1.3 心腎毒性相關(guān)疾病靶點獲取

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）搜索以“cardiotoxicity and nephrotoxicity”為關(guān)鍵詞的心腎毒性相關(guān)疾病的靶點蛋白，再將獲得的疾病靶點蛋白利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫核對蛋白名稱，確認(rèn)其對應(yīng)的Uniprot ID。

1.4 青蒿成分－心腎毒性PPI圖構(gòu)建及分析

由Draw Venn Diagram 在線平臺（http：//bioinformatics.psb.ugent.be）獲得中藥青蒿與心腎毒性相關(guān)疾病的交集靶點基因信息，并進(jìn)行Venn圖繪制。將交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string－db.org），設(shè)置物種為“homo sapiens”，作用閾值為“medium confidence ＞0.4”，繪制（Protein－protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。將獲取數(shù)據(jù)進(jìn)一步輸入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行參數(shù)分析，研究其蛋白相互作用關(guān)系。

1.5 通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行生物通路富集分析，設(shè)置生物物種為“homo sapiens”，獲得基因本體（GO），即包括生物途徑（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）；獲取京都基因與基因組百科全書（KEGG）相關(guān)數(shù)據(jù)。篩選前20條富集條目（P＜0.05），并繪制GO及KEGG富集圖。

1.6 青蒿成分－心腎毒性靶點－通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2軟件對青蒿的活性成分與心腎毒性的交集靶點，以及KEGG 相關(guān)通路基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，通過拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析及網(wǎng)絡(luò)圖的可視化，進(jìn)一步探究藥物與疾病的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 青蒿的活性成分及相關(guān)靶點

通過TCMSP 對中藥青蒿進(jìn)行檢索，共獲取126 種活性成分。經(jīng)ADME 篩選后最后獲得19 種主要活性成分，見表1。將靶點預(yù)測結(jié)果整合重復(fù)項后，共得到青蒿的靶點為203個。

表1 青蒿的19種主要活性成分

2.2 構(gòu)建青蒿“活性成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.8.2 軟件對青蒿的19 種主要活性成分及對應(yīng)靶點進(jìn)行繪制與分析，共獲得222 個節(jié)點（203 個靶點和19 個活性成分）和486 條邊。度值（Degree）是衡量節(jié)點與邊連接數(shù)量多少的數(shù)值，Degree值越大表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)運算結(jié)果得出Degree 值最大的前3 種成分為QH19（槲皮素，Quercetin）、QH6（山柰酚，kaempferol）和QH10（木犀草素，Luteolin），Degree 值分別是146、61、57；排名前3 的靶點分別為PTGS2、NCOA2、DPP4，Degree值分別是16、14、14。見圖1。

圖1 青蒿活性成分－靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 獲取心腎毒性相關(guān)靶點和構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫對心腎毒性靶點進(jìn)行檢索，最終刪除重復(fù)值獲得疾病靶點104 個。將藥物203 個靶點與疾病104 個靶點進(jìn)行Venn 圖繪制，見圖2。由Venn 圖可知藥物－疾病的共同靶點有36 個。將藥物與疾病的交集靶點導(dǎo)入STRING 在線平臺進(jìn)行分析與繪圖，構(gòu)建青蒿作用于心腎毒性的相關(guān)靶點的PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖2 青蒿活性成分－心腎毒性相關(guān)疾病靶點Venn圖

圖3 青蒿活性成分－心腎毒性相關(guān)疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 青蒿改善心腎毒性相關(guān)疾病的GO和KEGG通路分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對收集的36 個交集靶點進(jìn)行檢索，獲得GO（BP、CC、MF）和KEGG 通路的富集結(jié)果再篩選刪除，最后得到條目BP、MF、KEGG 各20 個和CC 17 個。通過R 語言將BP、CC、MF 通路繪制成條形圖，見圖4～圖6。其中橫軸代表節(jié)點的數(shù)量（Count），縱軸為通路名稱，條形顏色根據(jù)P值呈現(xiàn)漸變，顏色越紅則代表越顯著。以氣泡圖對KEGG 通路圖進(jìn)行可視化，橫軸為通路基因占總基因的比率，縱軸為通路名稱。氣泡的大小根據(jù)基因Count值調(diào)節(jié)，顏色則由P值大小呈現(xiàn)由藍(lán)到紅漸變，顏色越紅代表越顯著，見圖7。KEGG通路結(jié)果見表2。

表2 青蒿改善心腎毒性相關(guān)疾病靶點通路富集結(jié)果

圖4 基于分子功能的GO－BP富集分析圖

圖5 基于分子功能的GO－CC富集分析圖

圖6 基于分子功能的GO－MF富集分析圖

圖7 KEGG通路富集氣泡圖

2.5 構(gòu)建青蒿活性成分－心腎毒性靶點－通路網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行藥物成分－疾病靶點－通路構(gòu)建，見圖8。由分析的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)得知：槲皮素（Degree 值：31，Betweenness 值：0.351 2，Closenesss 值：0.588 7）可能是青蒿改善心腎毒性的關(guān)鍵成分。山柰酚、木犀草素、青蒿素的Degree值則分別為15、13、7，可能對青蒿治療心腎毒性相關(guān)疾病起到重要作用；由數(shù)據(jù)預(yù)測MAPK1（Degree 值：20，Betweenness 值：0.077 6，Closenesss 值：0.480 2）可能是作用的主要靶點，其次是PTGS2、MAPK14、TP53、CASP3、TNF，Degree值分別是19、16、15、14、14。

圖8 青蒿活性成分－心腎毒性靶點－通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

藥物的毒性反應(yīng)可能引起器官結(jié)構(gòu)的病理改變，甚至?xí)?dǎo)致患者死亡，是藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用面臨的巨大難題［7］。常見的藥物毒性損傷如鉑劑類抗癌藥的腎毒性損傷，研究表明接受順鉑治療的患者約有20%出現(xiàn)腎毒性改變［8］。此外，蒽環(huán)類藥物也會引起心臟毒性損傷，特別是心功能不全的老年患者，嚴(yán)重者可發(fā)生心力衰竭和心肌梗死［9］。目前尚無針對藥物所致心腎毒性損害的有效臨床藥物。中藥具有毒副作用小、治療效果好、作用靶點多的特點，且臨床研究表明中藥與抗癌藥物聯(lián)用可以達(dá)到增效減毒的作用［10］。ZHAI等［11］通過蒽環(huán)類藥物阿霉素作用于H9c2 細(xì)胞和小鼠的實驗，證實了黃芪提取物可以通過減少凋亡、抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)Sirt1－NLRP3 通路，對阿霉素誘導(dǎo)的心毒性起保護(hù)作用。

青蒿為清虛熱類中草藥，性味苦、辛、寒，《本草綱目》記載：“青蒿，治瘧疾寒熱”，隨著對青蒿及其提取物的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在治療癌癥方面具有一定的作用，這意味著青蒿及其提取物在未來抗癌藥市場可能占據(jù)重要地位［12］。目前針對青蒿抗癌作用的研究主要集中在青蒿素及其衍生物的作用機制探討，然而青蒿的有效成分很多，且其有效成分到底是通過減少藥物毒性還是抑制癌細(xì)胞等方面發(fā)揮作用，均需要深入研究。中醫(yī)認(rèn)為，心火與腎水互相交濟(jì)，以使君相安位、精血互生。《金匱要略》曰：“水不行，則心火氣盛”，若心腎不交則導(dǎo)致心火上炎，故以陰虛之證候多見，久則亦可致心腎陽虛。人體作為一個整體，心毒性與腎毒性亦是互相作用。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對青蒿主要活性成分改善心腎毒性相關(guān)疾病的機制進(jìn)行探究。

3.1 青蒿改善心腎毒性相關(guān)疾病的主要活性成分分析

由分析結(jié)果可知，槲皮素是青蒿改善心腎毒性的主要活性成分，此外還有山柰酚、木犀草素和青蒿素。目前研究認(rèn)為心腎毒性的發(fā)生可能與活性氧的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)以及凋亡密切相關(guān)［13］。槲皮素是一種黃酮類化合物，普遍存在于中藥、水果和蔬菜中，具有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗癌、抗氧化、抗炎和抗菌等。槲皮素可以通過促凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、PI3K/Akt、MAPK 等分子通路，減少細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯［14］。槲皮素具有雙向調(diào)節(jié)和劑量依賴的特點，即在低濃度時槲皮素作為一種抗氧化劑，可起到化學(xué)預(yù)防作用；在高濃度時槲皮素作為一種促氧化劑，可對化療的毒副作用起影響作用［15］。但槲皮素是一種親脂性化合物，只有改善其溶解性、生物累積性和傳遞進(jìn)入細(xì)胞系統(tǒng)的方式，才能更好地靶向治療癌癥［16］。山柰酚的攝入與各種癌癥的發(fā)病率下降有關(guān)，其中包括皮膚、肝臟、結(jié)腸、卵巢等器官癌癥［17］。其主要通過增加細(xì)胞凋亡來抑制癌細(xì)胞的增殖發(fā)揮對癌癥的預(yù)防作用，由于它的親脂性可通過被動或主動運輸在小腸中吸收。被吸收的山柰酚通過結(jié)腸中的細(xì)菌菌群代謝后，再通過糞便和尿液排出體外［18］。而富含木犀草素的中藥則有治療高血壓、炎癥相關(guān)疾病和癌癥的功效，木犀草素的抗癌功能可能與它的抗炎作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及氧化還原調(diào)節(jié)相關(guān)。木犀草素等黃酮類化合物是重要的天然抗氧化劑，在體內(nèi)外均有較強的抗癌作用［19］。此外，研究發(fā)現(xiàn)木犀草素單獨或聯(lián)合抗癌藥物使用，可促進(jìn)Bax/Bcl－2 的表達(dá)和p53 的表達(dá)，可以增強PARP 的裂解和減少二氫嘧啶脫氫酶生成，還可調(diào)節(jié)ICAM－1、LFA－3 和PCNA 等蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到治療肝癌的效果［20－21］。青蒿素作為一種過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，它除了抗瘧之外，還具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎的作用，而且這些功能與其過氧橋基團(tuán)密切相關(guān)［22］。屠呦呦團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)青蒿素衍生物雙氫青蒿素可通過抑制抗ds－DNA抗體的產(chǎn)生、TNF－α的分泌和NF－κB 信號通路，達(dá)到改善紅斑狼瘡相關(guān)腎炎的效果［23］。青蒿的主要活性成分均有一定的抗癌的作用，然而其藥理機制復(fù)雜，且當(dāng)前關(guān)于青蒿的研究較為分散尚未形成體系，仍需進(jìn)一步的針對性的研究才能使青蒿發(fā)揮其最大功效。

3.2 青蒿改善心腎毒性的關(guān)鍵靶標(biāo)和潛在通路分析

通過36 個交集靶點的分析結(jié)果顯示，青蒿改善心腎毒性的關(guān)鍵靶標(biāo)可能是MAPK1，此外依次還有PTGS2、MAPK14、TP53、CASP3、TNF、MAPK8、CASP9、BCL2 和BAX。由交集靶點的數(shù)據(jù)分析，得到KEGG 富集通路82 條和GO 富集284 個，其中包括BP 228 個、CC 20 個、MF 36 個。通過P值、Count 值和結(jié)合關(guān)鍵靶點綜合分析，發(fā)現(xiàn)青蒿改善心腎毒性的主要潛在通路集中于癌癥相關(guān)通路、TNF 信號通路、HIP－1 信號通路、VEGF 信號通路、MAPK信號通路和凋亡相關(guān)通路等。

研究發(fā)現(xiàn)線粒體損傷、免疫反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞死亡是大多數(shù)藥物毒性的發(fā)生和發(fā)病機制，然而其分子機制目前仍不清楚［24］。MAPKs 是一類可感知細(xì)胞外刺激并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶?；罨腗APKs 可磷酸化多種靶蛋白（如Bcl－2、BAX），進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增殖、氧化應(yīng)激和炎癥等［25］。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶2（COX－2），對癌變的發(fā)生或促進(jìn)過程，以及腫瘤細(xì)胞的放化療耐藥性均發(fā)揮作用。MAPK 家族如p38、ERK1/2 可參與COX－2 的誘導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡抵抗等。COX－2的抑制能提高癌癥的治療效果及增強癌細(xì)胞對化療的敏感性［26］。由TP53 基因編碼的p53 在細(xì)胞周期阻滯、DNA 修復(fù)和凋亡的調(diào)控中起著重要的抑癌作用，且p53 過表達(dá)、突變與抗癌藥物的耐藥性之間存在關(guān)聯(lián)，p53突變體可以恢復(fù)p53的抑瘤功能，增強其化療的敏感性，從而減少這些藥物的用量以降低其毒性［27］。CASP3、CASP9、BCL2、BAX則為凋亡信號通路分子，其中CASP3是細(xì)胞凋亡過程中重要的關(guān)鍵信號分子。

由分析靶點和通路分析結(jié)果可知，青蒿對心腎毒性的作用機制多與癌癥通路相關(guān)，這也與臨床上心腎毒性藥物多以抗癌藥為主的現(xiàn)象相符。TNF信號通路則與細(xì)胞增殖和炎癥、凋亡相關(guān)，其中TNF－α 是典型的促炎細(xì)胞因子，臨床研究及動物實驗表明抗癌藥能在體內(nèi)引起嚴(yán)重的全身炎癥，包括肝炎、腎炎、靜脈炎、黏膜炎等，而且TNF－α 表達(dá)增加與順鉑誘導(dǎo)的腎毒性相關(guān)［28］。此外，TNF 信號通路還能激活NF－κB 和MAPK 信號通路。HIP－1 信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，且可活化Caspase－8 促進(jìn)凋亡的發(fā)生。HIP－1 因子的過表達(dá)可減少癌細(xì)胞對生長因子的依賴從而獲得增殖優(yōu)勢，是前列腺癌和結(jié)腸癌的潛在治療靶點［29］。VEGF 信號通路則與腫瘤血管生成相關(guān)，可誘導(dǎo)下游ERK1/2信號通路，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和增殖［30］。

綜上所述，由網(wǎng)絡(luò)藥理分析可知青蒿減輕心腎毒性相關(guān)疾病的藥物主要活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素和青蒿素，其關(guān)鍵靶點則是MAPK1、PTGS2、MAPK14、TP53、CASP3 和TNF 等，主要潛在信號通路為癌癥相關(guān)通路、MAPK 信號通路、凋亡相關(guān)通路、TNF信號通路、HIP－1信號通路和VEGF信號通路等。藥物的心腎毒性對疾病的療效和患者的生活質(zhì)量都有重要的影響，由結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)青蒿對心腎毒性有保護(hù)作用，其作用可能通過多種機制實現(xiàn)。然而，關(guān)于青蒿及其活性成分對毒性的治療劑量閾值與給藥途徑，則仍需要進(jìn)一步的實驗和臨床研究進(jìn)行評估，從而達(dá)到改善毒性的作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對青蒿改善心腎毒性靶點進(jìn)行篩選，為日后實驗研究提供新思路，同時也證明了中藥在靶向治療惡性腫瘤方面具有一定潛力。