黃蜀葵花總黃酮通過激活A(yù)MPK/mTOR通路調(diào)控自噬改善克羅恩病腸道纖維化

張慧翔，張丹，錢海華，王雅麗，曾莉?

（1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210023）

克羅恩病（Crohn's disease，CD）是一種慢性、反復(fù)性的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），其臨床癥狀包括腹痛、腹瀉、發(fā)熱、疲勞和體質(zhì)量減輕［1］。腸道纖維化是CD 的常見并發(fā)癥之一。由于CD 的透壁性炎癥，纖維化可能涉及腸壁的所有層次，導致腸道的增厚和狹窄［2］，甚至造成腸梗阻。歐洲的一項隊列研究顯示，在被確診為CD 的5年內(nèi)，14%的患者出現(xiàn)狹窄或穿透性并發(fā)癥［3］。研究表明，狹窄性CD 對常用于治療CD 的TNF 抑制療法沒有明顯反應(yīng)［4］。當前腸道狹窄的主要治療方式為球囊擴張、狹窄成形術(shù)和手術(shù)切除，但大多數(shù)CD 患者會在術(shù)后出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)，需要進一步治療，其中大約20%的患者需要再次手術(shù)［5］。因此，有必要研發(fā)治療CD腸道纖維化的有效藥物。

自噬是一種細胞內(nèi)代謝機制，細胞質(zhì)中的物質(zhì)通過自噬體被送到溶酶體中被降解［6］。通過該過程，自噬在人體中發(fā)揮著保護細胞、保護組織和抗炎的作用［7］，對炎癥性疾病和自身免疫性疾病具有重要意義。據(jù)報道，CD的病因主要涉及基因易感性、家族史、環(huán)境因素、腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)和微生物群紊亂［1］。而自噬有關(guān)基因，包括IRGM、NOD2和ATG16L1等均與CD 密切相連［7-8］。綜上，自噬可能與CD 的發(fā)病有著內(nèi)在聯(lián)系。此外，研究表明自噬是多器官纖維化疾病的一個重要調(diào)節(jié)器［9］，從自噬角度出發(fā)可能會為治療CD 腸道纖維化提供新的治療機制。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP－activated proteinkinase，AMPK）是一種穩(wěn)健的能量狀態(tài)傳感器，由AMP與ATP狀態(tài)調(diào)節(jié)，啟動能量平衡機制［10］。mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）是雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）與伴生蛋白結(jié)合產(chǎn)生的差異信號綜合體，可根據(jù)營養(yǎng)環(huán)境調(diào)節(jié)細胞的生長和代謝［11］。AMPK/mTOR 通路是自噬上游的一條關(guān)鍵通路。在營養(yǎng)豐富時，mTORC1磷酸化ULK1，阻斷其被AMPK 激活，達到抑制自噬啟動的目的［12］。當處于營養(yǎng)不足時，AMPK 通過磷酸化和激活TSC2以及磷酸化并抑制Raptor（mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白）降低mTORC1的活性，同時磷酸化并激活ULK1，引發(fā)自噬級聯(lián)的啟動［10］。故本研究選用AMPK/mTOR 通路作為深入探討自噬與CD腸道纖維化內(nèi)在關(guān)聯(lián)的指標。

黃蜀葵花總黃酮（total flavone ofAbelmoschus manihot，TFA）是錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵花的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)等作用［13］。研究報道，TFA 可以通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變來緩解TGF－β 誘導的CD 腸道纖維化［14］，并減少腸道纖維化小鼠模型中的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積［15］。然而，其中的機制仍需進一步研究。

因此，本研究通過分離大鼠原代細胞，從細胞自噬的角度，探討TFA 對腸道成纖維細胞的作用及分子機制，為防治CD腸道纖維化提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

選擇健康SPF 級SD 雄性大鼠20 只，體質(zhì)量180～200 g，購自杭州醫(yī)學院，動物許可證號：SCXK（浙）2019－0002。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，溫度為23～25 ℃，相對濕度為50%～60%，每日光照12 h，大鼠被允許自由飲水與采食。所有實驗研究均依照南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物研究倫理規(guī)范和許可進行（倫理號：2020DW－30－01）。

1.2 藥物與試劑

TFA 由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑部提供；雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（上海MCE 公司，貨號：HY－10219）；胰島素樣生長因子－1（insulin－like growth factor－1，IGF－1）（美國Abcam 公司，貨號：ab198570）；AMPK 抑制劑化合物C（Compound C，CC）（selleck 公司，貨號：S7306）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（美 國Gibco 公 司，貨 號：10010023）；CCK－8試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0038）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 試劑盒（上海翌圣生物科技公司，貨號：11201ES03、11123ES60）。

Collagen Ⅰ、β－actin、LC3 Ⅱ、Beclin－1、p62、Vimentin、α－SMA、AMPK、mTOR、p－mTOR 抗體（美國Proteintech 公司，貨號：14695－1－AP、66009－1－Ig、14600－1－AP、11306－1－AP、18420－1－AP、10366－1－AP、14395－1－AP、10929－2－AP、66888－1－Ig、67778－1－Ig）；ATG16L1、p－AMPK、4EBP1、p－4EBP1、p70S6K、p－p70S6K 抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab188642、ab133448、ab32024、ab278686、ab32529、ab59208）；進口血清Opti－MEM（美國Gibco 公司，貨號：31985062）；mRFP－GFP－LC3 質(zhì)粒（上海GeneTalk公司，貨號GT－AP－V103）；Collagen Ⅰ、β－actin 引物序列均由通用生物公司設(shè)計。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱（上海SANYO），倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），臺式低速離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司），凝膠成像分析儀（上海勤翔），共聚焦顯微鏡（美國NIKON 公司），PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 提取大鼠原代腸道成纖維細胞

根據(jù)參考文獻［16-17］中的步驟，進行大鼠原代腸道成纖維細胞提取。將細胞培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，并根據(jù)細胞生長狀況更換培養(yǎng)基。

2.2 免疫熒光法鑒定原代腸道成纖維細胞

取IFs 細胞接種于6 孔板中，固定后，用PBS 清洗3次。0.1%Triton X－100透化，PBS清洗。5%BSA 液封閉20 min。加入Vimentin、α－SMA 抗體在4 ℃下孵育過夜。PBS 清洗后，加入二抗孵育1 h，清洗后滴加DAPI，封片觀察。

2.3 CCK－8法測定TFA和RAPA的最佳濃度及時間

將含有5 × 103個細胞的100 μL 細胞懸液置于96 孔板中。培養(yǎng)過夜后，用無血清培養(yǎng)基或含RAPA（1、5、10 nmol/mL）、含TFA（5、10、25、50、75、100、150、200 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后利用CCK－8 試劑盒檢測細胞生長狀況，在450 nm波長下進行讀數(shù)。

2.4 分組與干預(yù)

2.4.1 TFA 對IFs 細胞合成Ⅰ型膠原蛋白及自噬的影響

根據(jù)CCK－8的結(jié)果，選擇濃度為5、10、50 μg/mL 的TFA 作為TFA 的工作濃度。將IFs 細胞隨機分為對照組、模型組和TFA 低、中、高劑量組。對照組不做任何處理；模型組用100 ng/mL 的IGF－1 干預(yù)24 h；TFA 低、中、高劑量組用100 ng/mL 的IGF－1 干預(yù)24 h 后，再用5、10、50 μg/mL 的TFA 處理48 h。

2.4.2 TFA 與IFs 細胞中自噬相關(guān)通路AMPK/mTOR的關(guān)系

根據(jù)CCK－8 的結(jié)果，選擇濃度為5 nmol/mL 的RAPA 作為RAPA 的工作濃度。將IFs 細胞分為對照組、模型組、TFA組、TFA+CC組和TFA+RAPA組。對照組不做任何處理；模型組用100 ng/mL 的IGF－1 干預(yù)24 h；TFA 組用100 ng/mL 的IGF－1 干預(yù)24 h 后，再用10 μg/mL的TFA處理48 h；TFA+CC組用100 ng/mL的IGF－1 干預(yù)24 h 后，再 用10 μg/mL 的TFA 聯(lián) 合10 μmol/mL的CC處理48 h；TFA+RAPA組用100 ng/mL的IGF－1 干 預(yù)24 h 后，再 用10 μg/mL 的TFA 聯(lián) 合5 nmol/mL的RAPA處理48 h。

2.5 Western blot

使用RIPA 裂解液提取總蛋白，測定、統(tǒng)一蛋白質(zhì)濃度后煮沸變性。運用SDS－PAGE膠進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，加入稀釋后的一抗，4 ℃下過夜孵育。PBST洗滌3 次后，加入相應(yīng)二抗室溫下孵育1.5 h。清洗后借助凝膠成像分析儀曝光顯影，Image J 軟件分析灰度值，β－actin為內(nèi)參蛋白。

2.6 免疫熒光

除抗體外，其余步驟同“2.2”項下的處理方法。

2.7 qRT－PCR

Trizol 試劑提取細胞總RNA，測定RNA 濃度和純度后定量，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR 試劑盒設(shè)定PCR 擴增反應(yīng)體系，上機檢測。采用2－ΔΔCT法計算mRNA 相對表達量。β－actin 為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 qRT－PCR 引物序列

2.8 mRFP－GFP－LC3實驗檢測IFs細胞自噬流

轉(zhuǎn)染步驟參考Lipofectamine 2000 說明書進行。將含有mRFP－GFP－LC3 質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的空白DMEM 滴入6孔板，培養(yǎng)IFs細胞8 h。然后，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，用PBS 清洗IFs 細胞，采用共聚焦顯微鏡檢測。

2.9 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 8.0.2 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差表示（n= 3）。多組間的差異采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 原代腸道成纖維細胞的鑒定

根據(jù)免疫熒光結(jié)果所示，細胞表達Vimentin（綠色熒光），不表達α－SMA（無明顯熒光），細胞核呈藍色熒光，且95%以上的細胞均呈現(xiàn)該特征，證明提取的細胞為腸道成纖維細胞。見圖1。

圖1 免疫熒光鑒定細胞特征圖

3.2 TFA和RAPA的最佳工作濃度及干預(yù)時間

本研究選擇濃度為5、10、50 μg/mL 的TFA 和濃度為5 nmol/mL 的RAPA 作為工作濃度進行后續(xù)的實驗，干預(yù)48 h，對腸道成纖維細胞存活率影響見圖2和圖3。

圖2 TFA對IFs細胞存活率的影響

圖3 RAPA對IFs細胞存活率的影響

3.3 對IGF－1誘導的IFs細胞Collagen Ⅰ的影響

與對照組相比，模型組Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平顯著上升（P＜0.01）。與模型組相比，TFA低、中、高劑量組中的Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平明顯下調(diào)（P＜0.01），其中Collagen Ⅰ的表達與TFA濃度呈負相關(guān)，表明TFA 具有抑制IFs 細胞合成Ⅰ型膠原蛋白的作用。見圖4。

圖4 TFA對IFs細胞Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）合成的影響

3.4 TFA對IGF－1誘導的IFs細胞自噬的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白的表達減弱，p62 蛋白表達增強；與模型組相比，TFA 低中高劑量組中LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白表達水平增強，p62蛋白表達下降。見圖5。mRFP－GFP－LC3 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中細胞紅色熒光信號減弱，黃色熒光信號降低，表明自噬流減少；與模型組相比，TFA 低、中、高劑量組中紅色和黃色熒光信號均增強，自噬流增多，并且與TFA 濃度呈正相關(guān)。見圖6。mRFP－GFP－LC3 實驗和免疫熒光結(jié)果表明，TFA 能夠促進IFs 細胞自噬。

圖5 免疫熒光檢測TFA對IFs細胞中自噬相關(guān)蛋白的影響

圖6 mRFP－GFP－LC3檢測TFA對IFs細胞中自噬流的影響

3.5 AMPK/mTOR 通路對TFA 干預(yù)的IFs 細胞模型合成Ⅰ型膠原蛋白的影響

AMPK/mTOR通路是自噬的一個關(guān)鍵通路，本研究采用了AMPK抑制劑化合物C（CC）、mTOR抑制劑雷帕霉素（RAPA）與TFA聯(lián)合使用干預(yù)IGF－1誘導的IFs細胞。結(jié)果與TFA 組相比，TFA+CC 組Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平明顯上升（P＜0.01），TFA + RAPA組中Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平下降（P＜0.01），表明AMPK/mTOR通路對TFA抑制IGF－1誘導的IFs細胞合成Ⅰ型膠原蛋白有調(diào)控作用。見圖7。

圖7 AMPK/mTOR通路對TFA調(diào)節(jié)IFs細胞合成Ⅰ型膠原的影響

3.6 AMPK/mTOR 通路對TFA 干預(yù)的IFs 細胞模型自噬的影響

與TFA 組相比，TFA + CC 組的趨勢則相反，免疫熒光結(jié)果顯示，LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白水平減弱，p62 蛋白水平升高；TFA + RAPA 組中免疫熒光結(jié)果顯示，LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1 蛋白熒光表達上升，p62 蛋白熒光表達下降。 見圖8。mRFP－GFP－LC3 結(jié)果顯示，TFA+CC 組細胞中紅色及黃色熒光信號皆相對減少，自噬流下降；TFA+RAPA 組細胞中紅色熒光信號與黃色熒光信號均上升，自噬流增加。見圖9。表明AMPK/mTOR 通路對TFA 干預(yù)的IFs 細胞模型中的自噬具有調(diào)控作用。

圖8 AMPK/mTOR通路對TFA干預(yù)的IFs細胞模型中自噬相關(guān)蛋白的影響

圖9 AMPK/mTOR通路對TFA干預(yù)的IFs細胞模型中自噬流的影響

3.7 TFA 對IGF－1 誘導的IFs 細胞中AMPK/mTOR通路的影響。

與對照組相比，模型組中p－AMPK/AMPK 比值減少，p－mTOR/ mTOR、p－p70S6K/p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 比值增多（P＜0.01）。與模型組相比，TFA 組中p－AMPK/AMPK 比值上升 ，p－mTOR/mTOR、p－p70S6K/ p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 比值減弱（P＜0.01）。與TFA 組相比，TFA+CC 組下調(diào)了p－AMPK/AMPK 比值，上調(diào)了p－mTOR/mTOR、p－p70S6K/p70S6K 和p－4EBP1/4EBP1 的比值；TFA + RAPA 組則相反（P＜0.01）。說明TFA 可能對IGF－1 誘導的IFs細胞中AMPK/mTOR通路具有激活作用。見圖10。

圖10 TFA對IGF－1誘導的IFs細胞AMPK/mTOR通路的影響

4 討論

腸道纖維化作為CD最具危險性的并發(fā)癥之一，可能致使腸道狹窄和梗阻，給患者帶來極大的健康和經(jīng)濟負擔［18］。當前研究認為CD的慢性炎癥刺激腸道中ECM的過度沉積和肌肉增厚，造成腸道纖維化的發(fā)生［2］。ECM中膠原蛋白的沉積和交聯(lián)致使的腸道僵硬則促進了纖維化的進程［19］。據(jù)報道，CD 患者的腸道組織中成纖維細胞增殖更快［20］。Ⅰ型膠原蛋白是腸道成纖維細胞分泌的主要膠原蛋白（約80%），其作為ECM 的組成部分，進一步推動纖維化的發(fā)展［21］。因此，抑制腸道成纖維細胞合成Ⅰ型膠原蛋白是改善ECM、控制和預(yù)防腸道纖維化的一個重要方向。故本研究采用具有促進膠原蛋白產(chǎn)生和增殖作用的生長因子IGF－1［22］干預(yù)IFs細胞建立細胞模型，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過IGF－1處理后的IFs 細胞Collagen Ⅰ蛋白表達及mRNA 水平均明顯上升，表明細胞模型建立成功。當TFA 干預(yù)IGF－1誘導的IFs 細胞時，Collagen Ⅰ蛋白及mRNA 表達下降。說明TFA可以抑制IFs細胞中Ⅰ型膠原蛋白的合成。

自噬及其相關(guān)通路具有平衡炎癥和免疫的作用［23］。CD 作為炎癥性腸病的一種，與潰瘍性結(jié)腸炎相比，更容易受遺傳因素的影響［24］。而研究發(fā)現(xiàn)，CD 易感患者的自噬相關(guān)基因如ATG16L1、IRGM、LRRK2 和NOD2/CARD15 等表達失調(diào)，說明自噬在CD 病理過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用［25］。MaciasCeja 等［26］發(fā)現(xiàn)，用自噬激活劑RAPA 治療TNBS 誘導的小鼠模型可以降低促炎因子（TNF－α、COX－2、IL－1β、誘導型NOS和IL－6）水平，并增加抗炎因子IL－10 的表達。另一方面，自噬與ECM 也存在著復(fù)雜的關(guān)系［27］。研究發(fā)現(xiàn)［28］，在腸道纖維化模型小鼠中，自噬減弱，在刺激自噬后，腸道纖維化減輕，成纖維細胞的膠原蛋白降解增多，而抑制自噬則加劇纖維化，改變炎癥反應(yīng)，減弱膠原蛋白降解。表明自噬刺激可能是治療腸道纖維化的一個重要機制。在本研究中，TFA可以上調(diào)IFs細胞中自噬標志蛋白LC3Ⅱ、Atg16L1、Beclin－1的表達，降低自噬底物蛋白p62的水平，增加自噬流，表明TFA 具有激活I(lǐng)Fs細胞自噬的作用。

AMPK/mTOR 通路與自噬機制密切相關(guān)，并且能夠參 與 調(diào)控 纖維化 疾?。?］。p70S6K 和4EBP1 作 為mTORC1 的下游因子，其磷酸化可以促進蛋白質(zhì)合成。研究表明激活A(yù)MPK 通路、抑制mTOR/p70S6K通路可抑制心肌成纖維細胞的增殖，并減少細胞內(nèi)的α－平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白［29］。ZHANG等［30］報道通過激活A(yù)MPK/mTOR 通路刺激人真皮成纖維細胞的自噬，能夠抑制該細胞的增殖和遷移以改善術(shù)后關(guān)節(jié)纖維化。此外，文獻報道通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR 通路激活自噬可以改善腸道炎癥和損傷。GAO 等［31］發(fā)現(xiàn)尼古丁具有激活A(yù)MPK/mTOR 通路，增加自噬水平從而降低潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸損傷和炎性因子水平的作用。SU 等［32］也發(fā)現(xiàn)黃連素能夠調(diào)控AMPK/mTOR 通路降低潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜損傷，增加腸道菌群的豐度和有益菌的含量。因此，AMPK/mTOR 通路或許是改善CD 腸道纖維化的關(guān)鍵靶點。為探討TFA 調(diào)控IFs 細胞與AMPK/mTOR 通路是否存在聯(lián)系，本研究中使用AMPK 抑制劑CC 及mTOR 抑制劑RAPA 聯(lián)合TFA 處理IFs 細胞模型。發(fā)現(xiàn)TFA 聯(lián)合CC 處理IFs 細胞，會降低細胞中的自噬水平，促進Collagen Ⅰ的表達，而TFA 聯(lián)合RAPA處理IFs細胞，情況則與之相反。說明AMPK/mTOR 通路對TFA 干預(yù)IFs 細胞模型具有調(diào)控作用，激活A(yù)MPK/mTOR 通路能促進IFs 細胞的自噬，抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成。另外，實驗結(jié)果顯示，TFA 促進IFs 細胞中p－AMPK 蛋白表達，抑制p－mTOR、p－p70S6K、p－4EBP1蛋白水平，表明TFA能激活I(lǐng)Fs 細胞的AMPK/mTOR 通路。TFA 可能通過激活A(yù)MPK/mTOR通路調(diào)節(jié)自噬來抑制IGF－1誘導腸道成纖維細胞中I型膠原蛋白的合成。

綜上所述，本研究以腸道成纖維細胞為研究對象，從細胞層面探索TFA 對CD 腸道纖維化的作用及機制。實驗發(fā)現(xiàn)，TFA 通過調(diào)控AMPK/mTOR 通路，促進腸道成纖維細胞自噬，抑制腸道成纖維細胞合成Ⅰ型膠原蛋白，進一步證實了TFA 具有改善CD 腸道纖維化的作用，為TFA 治療CD 腸道纖維化的應(yīng)用提供了理論支持。但是，當前的研究只局限于體外實驗，未來仍有必要開展動物實驗，進一步驗證其中的機制。