基于PI3K/AKT通路探討洋甘菊提取物改善PCOS大鼠生殖功能的研究

杜 丹，樊榮華

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）影響育齡婦女生殖功能，目前尚不明確其發(fā)病原因與機制。該病主要的特點是高雄激素血癥，患者可表現(xiàn)為不出現(xiàn)閉經(jīng)情況但排卵已經(jīng)停止，是育齡期的女性不孕原因之一[1-2]。PCOS患者子宮內(nèi)膜變薄，其容受性與內(nèi)膜血流量下降，尚未明確機制。磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路（phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/AKT）為常見通路，其中PI3K 為異源二聚體，雌激素結(jié)合細(xì)胞需激活PI3K，有助于AKT 表達(dá)；AKT 活化后可擴張血管。PI3K/AKT 活化可提高子宮內(nèi)膜生長，促進(jìn)胚胎分化[3-4]。中醫(yī)將PCOS 歸屬于“月經(jīng)不調(diào)、不孕癥”范疇，腎虛為本、痰濕血瘀為標(biāo)。對于該類型婦科疾病，以補腎中藥材為最佳[5]。洋甘菊為東歐與南歐地區(qū)常見藥物植物，主要活性成分有酚類、類黃酮、植物雌激素[6]。洋甘菊提取物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、保護(hù)血管等作用[7]。本研究通過建立PCOS大鼠模型以觀察其高低濃度的洋甘菊提取物對大鼠生殖功能、PI3K/AKT 蛋白表達(dá)的機制進(jìn)行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 55 只成年雌性大鼠購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，SPF 級，合格證號SCXK(川)2020-24，體質(zhì)量100～200 g，鼠齡8～10 周。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后開始實驗。本實驗經(jīng)宜賓市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 參照[8]方法造模，對大鼠皮下注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)（購自麗珠制藥廠）30 U，每日1次，持續(xù)注射22 d；同時每日注射1 次胰島素（購自武漢優(yōu)爾生科技有限公司），前11 d皮下注射0.5 U，后逐漸增加劑量至6 U，維持注射至第22 天。大鼠每日注射藥物后檢查陰道涂片，連續(xù)觀察20 d，當(dāng)大鼠動情周期完全無變化則表示造模成功[8]。取10 只大鼠作為假手術(shù)組，剩余大鼠按模型制備成功造模后分為PCOS 組、洋甘菊提取物低劑量組及高劑量組，各15 只。給藥方式：造模后1 d 進(jìn)行灌胃給藥，假手術(shù)組（于造模期間為其注射生理鹽水，持續(xù)注射22 d）與PCOS組以4 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)給予生理鹽水；低劑量組以45 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)給予洋甘菊提取物（購自南京道斯夫生物科技有限公司），高劑量組以75 mg/kg 標(biāo)準(zhǔn)灌胃，兩組給藥體積均為4 mL/kg；每日1 次，持續(xù)給藥30 d。洋甘菊提取物濃度高低參考文獻(xiàn)[6]確定。取材：最后1 次給藥2 h 后麻醉處理；稱重，于腹主動脈部位取血置于離心管內(nèi)，離心后取血清，冷凍保存。摘除大鼠子宮稱重，并放于多聚甲醛中固定；子宮指數(shù)=子宮重量/體質(zhì)量。

1.2.2 血清樣本檢測 取冷凍保存的血清溶解，放射免疫分析法檢測血清的促卵泡生成激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、孕酮（progesterone，P）、雌二醇（estradiol，E2）、睪酮（testosterone，T）含量。

1.2.3 蘇木精-伊紅( hematoxylin-eosin，HE )染色 取子宮組織固定于多聚甲醛溶液內(nèi)，脫水，在二甲苯中透明，制切片；切片用蘇木素染色15 min后使用磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次；伊紅染色后PBS清洗透明，鏡下觀察病理變化。

1.2.4 卵巢組織觀察 取大鼠卵巢部位的組織，通過甲醛實施固定，再通過石蠟包埋、HE給予染色后放置在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理形態(tài)觀察。

1.2.5 免疫組化檢測 免疫組化檢測子宮容受性指標(biāo)白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)與整合素β3：雌激素檢測后各組選取5 只大鼠，當(dāng)日下午將大鼠放入籠內(nèi)，各個籠里放雄性大鼠2 只，第2 天觀測雌性大鼠的陰道情況，其中若發(fā)現(xiàn)了數(shù)量眾多的精蟲則確定妊娠首日，5 d 后處死雌鼠取其子宮，甲醛固定水化，靜置30 min后加1%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），用山羊血清封閉；加抗LIF、整合素β3抗體，再加入二抗，復(fù)染封皮；于顯微鏡下選無交叉的5 個視野計算其光密度值（optical density，OD值）。

1.2.6 免疫印跡法檢測 免疫印跡法對AKT、PI3K蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測：在子宮的組織內(nèi)加適量的胰蛋白裂解液，通過離心處理，之后取上層液體加入樣孔內(nèi)；接下來經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、浸泡TRIS 緩沖鹽溶液(TRIS buffered saline solution，TBS)，反復(fù)采用PBS給予沖洗，分別向聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上滴加一抗兔抗鼠PI3K、AKT（1:500），二抗（1:1 000），雜交后再次沖洗3次，放入ECL工作液內(nèi)檢測，獲取圖像。

1.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法檢測 PCR 方式對組織中的AKT 、PI3K mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測：采用適量的胰蛋白酶消化大鼠的子宮組織，之后在低溫條件下將其研磨成漿，將RNA 提取后用乙醇離心處理，冷凍保存；反應(yīng)條件為：于98 ℃進(jìn)行6 min；再于98 ℃下28 s，75 ℃下30 s，80 ℃下4 min，共55個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0 軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間行t檢驗；多組間采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量與子宮指數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，PCOS組體質(zhì)量與子宮指數(shù)顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.410，P＜0.05）；與PCOS 組比較，洋甘菊提取物低劑量與高劑量組大鼠體質(zhì)量與子宮指數(shù)顯著下降，且高劑量組比低劑量組更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.772，P＜0.05），表1。

表1 各組大鼠體征與子宮指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體征與子宮指數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與PCOS組比較，*P＜0.05；與洋甘菊的提取物低劑量組比較，&P＜0.05

組別假手術(shù)組PCOS組洋甘菊提取物低劑量組洋甘菊提取物高劑量組F P例數(shù)10 15 15 15體質(zhì)量（g）197.32±10.21 235.64±11.15#223.46±10.17*203.64±9.31*&39.410＜0.001子宮指數(shù)（mg/g）1.02±0.05 2.54±0.16#1.95±0.17*1.12±0.34*&149.772＜0.001

2.2 各組大鼠激素水平比較 與假手術(shù)組比較，PCOS 組LH 水平顯著上升，F(xiàn)SH、E2、P、T 水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為32.331、27.140、16.732、22.251、25.593，P＜0.05）；與PCOS 比較，洋甘菊提取物低劑量與高劑量組LH 水平下降，F(xiàn)SH、E2、P、T 水平上升，且高劑量組激素水平改善更佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表2。

表2 各組大鼠性激素水平比較（±s）

表2 各組大鼠性激素水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與PCOS組比較，*P＜0.05；與洋甘菊的提取物低劑量組比較，&P＜0.05

組別假手術(shù)組PCOS組洋甘菊提取物低劑量組洋甘菊提取物高劑量組F P例數(shù)10 15 15 15 LH（U/L）6.01±1.51 12.91±2.83#8.12±1.87*7.25±1.04*&32.331＜0.001 FSH（mU/mL）1.46±0.23 0.88±0.16#1.10±0.21*1.39±0.16*&27.140＜0.001 E 2（ng/L）31.16±5.67 18.82±3.54#25.56±4.02*26.39±4.71*&16.732＜0.001 P（μg/L）51.32±8.56 32.16±5.48#39.46±4.65*44.92±6.15*&22.251＜0.001 T（ng/mL 341.32±49.48 199.74±28.11*227.44±40.75*275.36±50.16*&25.593＜0.001

2.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)變化 假手術(shù)組鏡下見不同發(fā)育期的黃體與卵泡，偶爾可以發(fā)現(xiàn)排卵期清晰的卵泡結(jié)構(gòu)，卵泡壁時由多層的顆粒細(xì)胞構(gòu)成，且排列整齊、形態(tài)比較完成，未見囊性卵泡，圖1。PCOS 組鏡下見卵泡囊性病變，竇腔擴大，卵泡中無卵母細(xì)胞與放射冠，顆粒細(xì)胞層數(shù)下降，無成熟卵泡、黃體與排卵現(xiàn)象，圖2。洋甘菊提取物高劑量組鏡下可見成熟卵泡與黃體，數(shù)量略少于假手術(shù)組；部分卵泡結(jié)構(gòu)清晰，顆粒細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊，無囊性卵泡，圖3。

圖1 假手術(shù)組卵巢組織形態(tài)

圖2 PCOS組卵巢組織形態(tài)

圖3 洋甘菊提取物高劑量組大鼠卵巢組織形態(tài)

2.4 各組大鼠子宮容受性指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，PCOS 組LIF、整合素β3 蛋白的OD 值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為46.472、79.650，P＜0.05）；與PCOS 比較，洋甘菊提取物低劑量與高劑量組LIF、整合素β3蛋白的OD值上升，且高劑量組OD值更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表3。

表3 各組大鼠子宮容受性指標(biāo)的OD值比較（±s）

表3 各組大鼠子宮容受性指標(biāo)的OD值比較（±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與PCOS組比較，*P＜0.05；與洋甘菊的提取物低劑量組比較，&P＜0.05

組別假手術(shù)組PCOS組洋甘菊提取物低劑量組洋甘菊提取物高劑量組F P例數(shù)10 15 15 15 LIF蛋白0.42±0.09 0.16±0.04#0.36±0.05#0.40±0.08#*46.472＜0.001整合素β3蛋白0.39±0.07 0.14±0.03#0.37±0.05#0.43±0.07#*79.650＜0.001

2.5 各組大鼠卵巢組織PI3K、AKT 蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，PCOS 組卵巢組織PI3K、AKT 蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為100.311、46.663，P＜0.05）；與PCOS 比較，洋甘菊提取物低劑量與高劑量組PI3K、AKT 蛋白表達(dá)上調(diào)，且高劑量組PI3K、AKT 蛋白上調(diào)高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖4。

圖4 各組大鼠卵巢組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)圖

2.6 各組大鼠卵巢組織PI3K、AKT mRNA 表達(dá)與假手術(shù)組比較，PCOS 組卵巢組織PI3K、AKT mRNA 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與PCOS比較，洋甘菊提取物低劑量與高劑量組PI3K、AKT mRNA 上升，且高劑量組PI3K、AKT mRNA 高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表4。

表4 各組大鼠卵巢組織PI3K、AKT mRNA表達(dá)（±s）

表4 各組大鼠卵巢組織PI3K、AKT mRNA表達(dá)（±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與PCOS組比較，*P＜0.05；與洋甘菊的提取物低劑量組比較，&P＜0.05

組別假手術(shù)組PCOS組洋甘菊提取物低劑量組洋甘菊提取物高劑量組F P例數(shù)10 15 15 15 PI3K mRNA 1.03±0.15 0.26±0.09#0.84±0.12*0.96±0.16*&100.311＜0.001 AKT mRNA 0.98±0.21 0.31±0.08#0.75±0.17*1.12±0.28*&46.663＜0.001

3 討論

PCOS 不僅對患者生殖功能有影響，還因異常代寫導(dǎo)致糖尿病、動脈硬化等并發(fā)癥。因此，治療PCOS 或PCOS 伴胰島素抵抗需兼顧改善生殖功能與糾正代謝[9]。西醫(yī)能夠利用環(huán)丙孕酮等藥物將患者的內(nèi)源性雌激素進(jìn)行調(diào)節(jié)，但該手段對子宮內(nèi)膜的發(fā)育具有一定程度的影響，且降低患者的妊娠率。中醫(yī)在治療PCOS 方面具有一定的優(yōu)勢，中醫(yī)講究辨證論治、標(biāo)本兼治理念。補腎藥物可調(diào)節(jié)機體垂體的功能，改善PCOS 患者的卵巢癥狀[10-11]。洋甘菊是一類草木藥物，其藥理活性比較廣泛，可對內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜氧化應(yīng)激作用[12]。

PCOS 患者體內(nèi)的激素水平出現(xiàn)紊亂，其雄激素過高表達(dá)，相對健康人群FSH 水平較低，F(xiàn)SN 的分泌能加速卵泡的成熟，且水平會跟隨經(jīng)期變化而產(chǎn)生變化，F(xiàn)SH 的水平可間接呈現(xiàn)出患者的卵巢功能，對PCOS 診斷具有很強的臨床意義[12]。LH 穩(wěn)定表達(dá)于健康機體，PCOS 體內(nèi)含量上升，該結(jié)果與PCOS 胰島素抵抗障礙有關(guān)。胰島素能上調(diào)LH，刺激雄激素而增加其合成，提高睪酮水平[13]。E2在健康女性體內(nèi)水平較為穩(wěn)定，PCOS 患者中E2 水平較低[14]。中醫(yī)治療從痰濕、瘀血等方面著手[15]。洋甘菊為菊科植物，具有降血壓及膽固醇、通便發(fā)汗等功效[16]。研究顯示，洋甘菊提取物有降糖效果，且能改善小鼠糖耐量，能治療糖尿病[17]。多數(shù)PCOS 患者存在不同程度胰島素抵抗，且患者并發(fā)2 型糖尿病風(fēng)險增加。洋甘菊提取物中含有黃酮，該物質(zhì)能降糖、抑制葡萄糖代謝酶活性、改善胰島素抵抗及抗氧化損傷等[18]。本研究中洋甘菊提取物低劑量與高劑量組大鼠子宮指數(shù)相對于PCOS 組有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合激素水平調(diào)節(jié)，說明洋甘菊提取物能改善患者生殖功能。子宮的容受性功能相關(guān)指標(biāo)主要由整合素β3 與LIF，研究發(fā)現(xiàn)，不孕不育女性，子宮內(nèi)膜的整合素β3 與LIF 表達(dá)下降甚至不表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)水平后可以明顯的改善子宮內(nèi)膜的容受性。LIF能夠提高整合素β3的表達(dá)，提高子宮內(nèi)膜與胚泡的黏附性，增加患者的妊娠率。PCOS 患者體內(nèi)的整合素β3 表達(dá)存在異常，可造成子宮內(nèi)膜容受性出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致不孕癥。洋甘菊提取物能改善PCOS大鼠的血清激素代謝情況，提高雌性大鼠的妊娠率，調(diào)節(jié)整合素β 3和LIF子宮容受性相關(guān)指標(biāo)水平。

PI3K/AKT 的信號通路為重要調(diào)節(jié)因子，與PCOS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。PCOS 患者體內(nèi)的胰島素分泌增加，可改變MAPK 表達(dá)從而激活轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期蛋白活性。AKT 是PI3K的下游相關(guān)靶蛋白，在PCOS 中磷酸化的PI3K，可以調(diào)節(jié)GSK-3β 抑制糖原合成。PIEN 為PI3K 信號負(fù)調(diào)控因子，可確保卵巢排卵并對PI3K 表達(dá)具有促進(jìn)作用。劉敏[20]研究中建立PCOS 大鼠的模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-320UI 能夠保護(hù)卵巢，作用機理和PI3K/AKT相關(guān)信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，洋甘菊提取物能上調(diào)PCOS 大鼠血清雌激素水平，提高子宮容受性，且穩(wěn)定雌激素水平，其病情改善呈現(xiàn)濃度依懶性，其作用機制可能與PI3K/AKT通路有關(guān)。