黃芩苷對血液腫瘤的作用機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥的研究進(jìn)展

段曉暉，李 宏，王健紅，呂 垚，王世雄，王冰璇，梁 蓉

血液腫瘤是指發(fā)生在血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，以造血干細(xì)胞異常分化和增殖為特征，嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病。在世界所有癌癥總發(fā)病率中，血液腫瘤的發(fā)病率居第6 位，青少年惡性腫瘤病死率中位列1 位[1]。臨床上常見的血液腫瘤有白血病、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征等。對于血液系統(tǒng)腫瘤，目前主要的治療還是依靠傳統(tǒng)的化療或者聯(lián)合放療以及靶向治療、免疫治療，有條件可行造血干細(xì)胞移植。盡管如此，仍有部分患者出現(xiàn)疾病的難治或復(fù)發(fā)，化療效果不理想，尤其是長期治療后毒副作用明顯，耐受性差，治療相關(guān)死亡率增高。中藥作為放療和化療的輔助治療手段，顯著提高了患者生存質(zhì)量和生存率[2]。最新的Meta 分析顯示對于惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者，中藥聯(lián)合伊班膦酸鈉可以緩解疼痛癥狀、改善生活質(zhì)量，并且安全性與單純伊班膦酸鈉治療相當(dāng)[3]；中藥復(fù)方能明顯降低腫瘤質(zhì)量，提高腫瘤抑制率，降低微血管密度，進(jìn)而促進(jìn)HepG2 肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞壞死[4]。其中黃芩苷(Baicalin)就是重點研究的天然藥物之一，它是從黃芩根中提取的一種有顯著生物活性的黃酮類化合物,具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，同時可起到抑菌、抗炎、利尿、抗解痙、抗氧化劑及抗血栓等作用，研究證實其在消化道腫瘤、乳腺癌等腫瘤治療方面顯示出明顯優(yōu)勢[5-8]。有研究通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)黃芩中黃芩苷占21%，進(jìn)一步的研究證實黃芩苷是黃芩的主要抗癌成分，同時可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯抑制急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的生長，并且認(rèn)為黃芩對這些造血系統(tǒng)惡性腫瘤的治療應(yīng)列入臨床試驗[9]。

本文首先闡述黃芩苷在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液系統(tǒng)疾病中的相關(guān)研究及抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)展?fàn)顩r，同時將對黃芩苷的聯(lián)合用藥及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用加以總結(jié)分析，使大家對黃芩苷的抗腫瘤效應(yīng)有更為清晰的全面了解，以期為進(jìn)一步的臨床研究及應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ)。

1 黃芩苷在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤中的相關(guān)研究

1.1 黃芩苷對白血病細(xì)胞的作用及分子機(jī)制的研究 白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,起病急，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、乏力等，根據(jù)白血病細(xì)胞的分化成熟程度和自然病程，可分為急性白血病和慢性白血病兩大類。其次,根據(jù)受累的細(xì)胞系可將急性白血病分為急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL）和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。該病治療上主要以化療為主，造血干細(xì)胞移植可進(jìn)一步清除腫瘤細(xì)胞，延長生存期，但仍有部分患者后期復(fù)發(fā)，對治療反應(yīng)差，高強(qiáng)度的化療嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。

絕大多數(shù)研究提示黃芩苷可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡起到抗腫瘤作用。體外研究用濃度為32 μg/mL 和64 μg/mL 的黃芩苷處理NALM 細(xì)胞系（B-ALL）24 h后，與對照組相比，凋亡細(xì)胞百分比由6.4%分別增加到17.6%和21%，表明黃芩苷單獨治療(32 μg/mL和64 μg/mL)增加了ALL患者的凋亡細(xì)胞數(shù)量。同時發(fā)現(xiàn)黃芩苷對健康對照組的外周血淋巴細(xì)胞凋亡無顯著影響[10]。另一研究用20 mol/L黃芩苷作用耐藥的AML HL-60/ADR細(xì)胞系24 h后，出現(xiàn)G1 以下高峰，且隨黃芩苷濃度升高比例升高。80 mol/L 黃芩苷處理細(xì)胞后，Bcl-2 mRNA 表達(dá)隨時間的延長呈下降趨勢。Bcl-2、PARP 蛋白表達(dá)量顯著降低，PARP、Caspase-3、Bad 蛋白表達(dá)量逐漸升高,治療組與對照組之間AKT 表達(dá)無顯著差異,而p-Akt、NF-kappaB、p-NF-kappaB、mTOR和p-mTOR 的表達(dá)水平均呈時間依賴性降低，表明黃芩苷可能通過PI3K/AKT 信號通路誘導(dǎo)HL-60/ADR細(xì)胞凋亡[11]。此外也有研究者證實ROS通過表達(dá)Gadd153 和線粒體依賴通路介導(dǎo)黃芩苷誘導(dǎo)AML HL-60 細(xì)胞凋亡[12]。另一研究用T-ALL細(xì)胞系CCRF-CEM 為研究對象，發(fā)現(xiàn)黃芩苷對CCRF-CEM 具有顯著的細(xì)胞毒作用，其IC(50)值為10.6 μ g/mL，黃芩苷(37.5 μ g/mL)對p53和Fas蛋白表達(dá)無影響，治療72 h后，Bcl-2表達(dá)降低(22.0 pg/mL)，導(dǎo)致線粒體跨膜電位丟失(52.7%)，使細(xì)胞色素c含量升高(19.2 μg/mL)，最終激活caspase-3(50.1 pmol/min)。故認(rèn)為在人白血病細(xì)胞系中，黃芩苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由bcl-2依賴而非p53依賴途徑介導(dǎo)的[13]。

除了凋亡途徑，相關(guān)研究表明黃芩苷可通過調(diào)節(jié)Notch信號通路及細(xì)胞周期途徑進(jìn)一步起到抗腫瘤作用。有學(xué)者利用黃芩苷處理可調(diào)節(jié)內(nèi)源性Notch 信號通路，引起K562 細(xì)胞中Notch1 受體和Notch 靶基因的mRNA 表達(dá)水平,說明該藥物對Notch信號的調(diào)節(jié)可能影響K562細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[14]。

1.2 黃芩苷在MM 細(xì)胞的作用及分子機(jī)制的研究MM 是單克隆性漿細(xì)胞異常增生產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白，導(dǎo)致正常免疫球蛋白合成受抑，可出現(xiàn)貧血、骨折、腎功異常等臨床表現(xiàn)，多見于中老年人，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，屬于難以治愈的疾病。硼替佐米、來那度胺等藥物的應(yīng)用提高了療效，延長了患者的中位生存期，但依然有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治，預(yù)后極差。即便自體干細(xì)胞移植后，標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險患者仍需要來那度胺維持，而高風(fēng)險MM 患者則需要硼替佐米維持[15]，因此藥物相關(guān)的神經(jīng)毒性非常常見。而感染是MM 死亡的第二大原因，正在進(jìn)行的研究導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因VZV 疫苗的開發(fā)，從而無需使用減毒活疫苗，預(yù)計在不久的將來，其他疫苗的有效性和安全性將進(jìn)一步提高[16]。

在2005 年，研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯(HLJDT)可抑制MM 細(xì)胞系的增殖和原發(fā)性MM 細(xì)胞，特別是MPC-1-未成熟MM 細(xì)胞的存活，并通過線粒體介導(dǎo)途徑通過降低線粒體膜電位和激活caspase-9 和caspase-3 誘導(dǎo)MM 細(xì)胞系的凋亡。并進(jìn)一步實驗證實HLJDT中的黃芩對MM 細(xì)胞增殖有抑制作用，且黃芩中黃芩黃素較黃芩苷或漢黃芩素表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用[17]。有研究者進(jìn)一步將MM 細(xì)胞株U266 細(xì)胞分為4 組,即空白組、地塞米松組、黃芩苷組、地塞米松+黃芩苷組分別培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制MM 細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，作用效果與地塞米松類似，與地塞米松聯(lián)用，二者均可下調(diào)Wnt 通路調(diào)節(jié)分子β-catenin、GSK 3β 及下游靶基因c-myc、cyclinD1 mRNA 的表達(dá)，可下調(diào)β-catenin、GSK 3β 蛋白表達(dá)量，故可能通過調(diào)節(jié)Wnt 通路及其下游因子的表達(dá)而調(diào)控MM細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[18]。

另一研究發(fā)現(xiàn)黃芩黃素、漢黃芩素、黃芩苷對RPMI-8226 細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。相應(yīng)的，在體外可顯著降低RPMI-8226 中ABCG2 蛋白的表達(dá)水平，研究結(jié)果證實了黃芩提取物及其主要活性黃酮類化合物的一種新的作用機(jī)制，即通過調(diào)節(jié)ABCG2 蛋白的表達(dá)，靶向作用于SP 細(xì)胞，為MM 干細(xì)胞的靶向治療提供了新的思路[19]。

1.3 黃芩苷在淋巴瘤細(xì)胞的作用及分子機(jī)制的研究 淋巴瘤是一種原發(fā)于淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤,臨床上分為霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)。在NHL中B細(xì)胞淋巴瘤占到80%以上。近年來，淋巴瘤的發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢，根據(jù)最新的2019 年國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)，發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第9位,占女性惡性腫瘤的第7 位。部分患者后期仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治，預(yù)后極差，生活質(zhì)量嚴(yán)重受到威脅。

有研究顯示用黃芩苷治療CA46伯基特淋巴瘤細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞增殖率明顯下降；IC50 值為10 μM，10 μM 黃芩苷幾乎完全抑制菌落形成，黃芩苷能降低AKT 表達(dá)水平，抑制AKT 及其下游信號的磷酸化水平，降低核因子κB（nuclear factor-κB,NFκB）水平，提高NF-κB 抑制劑（inhibitor of NF-κB,IκB）水平，細(xì)胞質(zhì)中抗凋亡作用的NF-κB與其抑制劑IκB 形成復(fù)合體，為失活狀態(tài)，活化的AKT 可誘導(dǎo)IκB 磷酸化并使游離的NF-κB 入核，啟動抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，故黃芩苷可通過下調(diào)抗凋亡信號通路，上調(diào)磷脂酰肌苷-3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)信號通路凋亡組分起到抗腫瘤作用[20]。另一研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷衍生物02-036 能有效抑制CA46細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其相關(guān)機(jī)制可能與下調(diào)凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平有關(guān)，如BCL-2、Procaspase-9、Pro-caspase-3、PARP 和C-MYC[21]。還有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制T淋巴瘤Molt4細(xì)胞的生長,不同質(zhì)量濃度的黃芩苷可明顯抑制Molt4細(xì)胞的增殖能力（P值均＜0.05），IC50 值為（19.2±2.2）μg/mL，并通過刺激ROS 生成從而誘導(dǎo)Molt4 細(xì)胞的凋亡[22]。但目前黃芩苷在淋巴瘤方面研究較少。新的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過miR-217/Dickkopf1（DKK1）抑制Wnt/β-catenin 信號通路和c-MYC mRNA 表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤的作用[23]。近年來，中藥在免疫微環(huán)境的作用備受關(guān)注，而腫瘤細(xì)胞表面細(xì)胞程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）結(jié)合細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表面的程序性死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）抑制CTL 的抗腫瘤效應(yīng)，對免疫調(diào)節(jié)有抑制作用，造成腫瘤免疫逃逸[24]。黃芩苷能夠抑制腫瘤表面免疫檢查點，進(jìn)而刺激免疫反應(yīng)的作用，臨床上先后有多個抗PD-1 的單克隆抗體上市，如所熟悉的信迪利單抗、替雷利珠單抗等，用藥也逐漸納入指南，尤其B 細(xì)胞淋巴瘤的研究進(jìn)展非?？?，最新研究發(fā)現(xiàn)ADD3有望作為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤獨立預(yù)后標(biāo)志物，為其提供參考靶點[25]。因此黃芩苷也有望成為一個免疫治療的輔助藥物之一。

2 黃芩苷與化療藥物的聯(lián)合用藥及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥機(jī)制

六亞甲基雙乙酰胺(Hexamethylene bis-acetamide,HMBA)可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞分化，已有其在骨肉瘤、胃癌、肝癌、食管癌、卵巢癌等領(lǐng)域抗腫瘤機(jī)制的相關(guān)研究，且有部分應(yīng)用于臨床。有研究將20 μg/mL 黃芩苷與2 mM HMBA 合用24 h 后，對HL-60 細(xì)胞抑制率明顯提高（P＜0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義，提示聯(lián)合治療對HL-60 細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用，為了確定協(xié)同作用是否僅限于HL-60 細(xì)胞，他們還在其他人白血病細(xì)胞系K562、thp1 和NB4上進(jìn)行了平行研究，得到了相同的結(jié)果。而在這些細(xì)胞系中，聯(lián)合治療對HL-60 細(xì)胞的抑制作用最為顯著。因此證實了黃芩苷和HMBA 聯(lián)合作用可以協(xié)同抑制AML 細(xì)胞的增殖。另一方面，黃芩苷聯(lián)合HMBA 對健康志愿者外周血單個核細(xì)胞的毒性作用不大，揭示了黃芩苷和HMBA的新組合可能是一種有前途的治療AML的方案[26]。

順鉑是血液腫瘤較常用的化療藥物之一，目前黃芩苷與順鉑聯(lián)合在血液病治療中的研究甚少，在卵巢癌、肺癌細(xì)胞中研究均發(fā)現(xiàn)其對順鉑有一定的增敏作用。據(jù)報道,通過研究對順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞株A2780(CSC)及對應(yīng)的順鉑耐藥細(xì)胞株(CRC)細(xì)胞的凋亡和自噬發(fā)現(xiàn)包括黃芩苷在內(nèi)的黃芩提取物中的功能性化合物，聯(lián)合順鉑治療明顯降低了CRC 的細(xì)胞活力，細(xì)胞死亡是通過增加Atg5 和Atg12 表達(dá)的自噬而介導(dǎo)的，提示聯(lián)合用藥治療順鉑耐藥卵巢癌非常有前景[27]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)黃芩苷（8 μg/mL）和DDP（4 μg/mL）合并使用時，在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和耐順鉑的細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP中，腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制率均顯著提高，黃芩苷能劑量依賴性地降低A549/DDP 細(xì)胞中MARK2 的mRNA 和MARK2 及p-AKT 蛋白的表達(dá)，提示黃芩苷和順鉑在適當(dāng)劑量和孵育時間下能協(xié)同抑制人肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，順鉑抵抗力的減弱與MARK2和p-AKT的下調(diào)有關(guān)[28]。

氟尿嘧啶是尿嘧啶的同類物，廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療。體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞BEL-7402 及其耐藥細(xì)胞BEL-7402／5-Fu，研究發(fā)現(xiàn)5、10 mg／L 黃芩苷能部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對氟尿嘧啶的耐藥，可以增強(qiáng)BEL-7402 對氟尿嘧啶敏感性，增加耐藥細(xì)胞內(nèi)藥物積聚，降低MDRl基因及P—gP蛋白表達(dá)，抑制耐藥細(xì)胞黏附率，降低耐藥細(xì)胞β1-整合素表達(dá)，促進(jìn)E-CD 蛋白表達(dá)，提示黃芩苷體外能部分恢復(fù)肝癌耐藥細(xì)胞對Fu 的敏感性，可能與細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加及抑制MDRl基因表達(dá)相關(guān)[29]。阿霉素是血液系統(tǒng)腫瘤常用的化療藥物之一，研究顯示黃芩苷與阿霉素也有協(xié)調(diào)作用，可以下調(diào)HL-60/ADM細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1）和肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-associated protein,LRP）的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，增強(qiáng)阿霉素療效，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。

3 總結(jié)與展望

目前，腫瘤的發(fā)生率逐漸上升，治療上不僅僅局限于傳統(tǒng)的化療，一些新型靶向藥物的出現(xiàn)，越來越多的臨床醫(yī)生及患者更加青睞于無化療方案，中藥作為最傳統(tǒng)的用藥，隨著各種研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤機(jī)制廣泛且不良反應(yīng)少，相關(guān)研究越來越多，中藥現(xiàn)代化是醫(yī)學(xué)發(fā)展適時而存的必然趨勢。

黃芩苷可通過多種途徑起到抗腫瘤的作用，如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境等，迄今黃芩苷在白血病、MM、淋巴瘤中的相關(guān)研究都處于細(xì)胞實驗階段，大多為分子層面的研究，具體作用機(jī)制研究文獻(xiàn)有限且研究進(jìn)度緩慢，臨床應(yīng)用文獻(xiàn)鮮見，僅有極少數(shù)研究有逐漸向臨床過渡趨勢。新的研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷尤其對MLL 和PBX1 基因重排的白血病細(xì)胞系作用明顯，可以抑制細(xì)胞增殖，通過激活caspase3/7誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且黃芩苷處理可抑制糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、上調(diào)周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1，更重要的是發(fā)現(xiàn)在臨床收集了22 例ALL患者的骨髓細(xì)胞標(biāo)本，用50 μg/ml的SBE和16 μg/ml的黃芩苷進(jìn)行細(xì)胞凋亡研究，發(fā)現(xiàn)其對16 例（占比72%）兒童白血病骨髓細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用，其余6例患者中分離出的骨髓基質(zhì)細(xì)胞對SBE/黃芩苷治療無效，同時健康細(xì)胞和母細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)量均未增加。不幸的是，沒有患者發(fā)生MLL 易位或TCF3-PBX1 重排[31]。綜上，可以預(yù)期黃芩苷有機(jī)會被用于“量身定制”的治療，而不是僅基于疾病遺傳背景的“一刀切”療法。同時，近年來也以黃芩苷骨架為基礎(chǔ)開發(fā)一些列的新型抗癌藥物，設(shè)計合成了多種新型的黃芩苷衍生物，其中，C-6 位含N,N-二甲氨基乙氧基的化合物8 在體外對HL-60 細(xì)胞的抗增殖作用顯著增強(qiáng)，提示化合物8 的水溶性的改善和抗白血病的效力可能是一個非常有前景且待進(jìn)一步開發(fā)的導(dǎo)物[32]。

同時鑒于黃芩苷對化療藥物有一定的增敏作用，在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)耐藥，未來聯(lián)合用藥療效可期，因此該藥具有很好的臨床應(yīng)用前景。但現(xiàn)階段迫切需要更多有效可靠的研究數(shù)據(jù)去進(jìn)一步證實其的抗腫瘤作用機(jī)制，同時，黃芩苷與化療藥物的協(xié)同作用及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的研究也非常局限，僅局限于HMBA、順鉑、5-FU、阿霉素這些屈指可數(shù)的幾種藥物，急需在后續(xù)的研究過程中不斷發(fā)掘越來越多的藥物，探索最佳的組合，最大程度起到抑制腫瘤增長作用及逆轉(zhuǎn)耐藥，加之對黃芩藥物相互作用引起的不良反應(yīng)評價的研究，尤其是臨床試驗方面的數(shù)據(jù)較少，故只有將體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，將臨床前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床意義的治療策略，才有望為廣泛的臨床應(yīng)用做好充分的準(zhǔn)備，后續(xù)還需要學(xué)者們的進(jìn)一步努力。