鼻黏膜復(fù)合佐劑LTB-Rg1在小鼠體內(nèi)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗的增強(qiáng)作用及其生物安全性評價

蘇菲，薛銀，徐麗華，李軍星，余斌，袁秀芳*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，杭州 310018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的一種急性接觸性傳染病，嚴(yán)重影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。PRRSV主要通過呼吸道入侵豬體內(nèi)，并且能在豬肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，從而破壞巨噬細(xì)胞免疫體系，造成機(jī)體的非特異性免疫功能下降[2]。呼吸道黏膜是防御PRRSV 的第一道屏障，和肌內(nèi)注射、靜脈注射等免疫途徑相比，通過鼻黏膜途徑免疫能夠更有效和更直接地在動物體局部建立起免疫反應(yīng)，是抵御PRRSV 入侵較為理想的方法。由于黏膜結(jié)構(gòu)的特殊性，黏膜途徑免疫對疫苗的穩(wěn)定性和免疫原性要求較高。盡管PRRSV 滅活疫苗比減毒活疫苗更安全，但是其免疫原性較弱，單獨(dú)免疫并不能達(dá)到理想的保護(hù)作用[1,3]，因此需要尋找合適的黏膜佐劑來加以輔助。

大腸埃希菌不耐熱腸毒素B 亞單位（B subunit of heat-labile enterotoxin, LTB）是一種較好的黏膜免疫佐劑，在小鼠、雞和豬等動物體內(nèi)對多種疫苗均具有免疫增強(qiáng)作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，LTB所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與免疫途徑有關(guān)。REN 等[6]發(fā)現(xiàn)：LTB 通過滴鼻途徑給藥能夠顯著提高小鼠體內(nèi)H5N1病毒樣顆粒特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且能夠在小鼠感染同源或異源毒株后明顯提高其存活率；而LTB 通過肌內(nèi)注射給藥只能提高小鼠體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答水平，不能保護(hù)小鼠免受同源或異源毒株的感染。類似的，LEE 等[7]發(fā)現(xiàn)LTB 經(jīng)滴鼻免疫后能顯著提高福氏耐格里阿米巴原蟲Nfa1 蛋白的特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）和免疫球蛋白A（IgA）抗體水平以及脾淋巴細(xì)胞中干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白介素-2（interleukin-2,IL-2）等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，并且能夠明顯提高小鼠在感染福氏耐格里阿米巴原蟲后的存活率。另外，LEI 等[8]也發(fā)現(xiàn)LTB 與H5N1 血凝素重組乳酸乳球菌一同滴鼻免疫雞后，能夠顯著增強(qiáng)血清中的特異性IgG和鼻黏液中的特異性IgA抗體水平以及中和抗體水平，并且為感染雞提供100%的保護(hù)力。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)，LTB 作為肺炎支原體黏附素P97 抗原佐劑時，通過肌內(nèi)注射免疫偏向于增強(qiáng)Th2 型免疫應(yīng)答，而通過滴鼻途徑免疫偏向于增強(qiáng)Th1 型免疫應(yīng)答[9]。人參皂苷Rg1 屬于原人參三醇型皂苷，是人參根和莖葉中的主要皂苷單體[10]。研究表明，人參皂苷Rg1 在動物體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，具有佐劑功能。YUAN 等[11]發(fā)現(xiàn)通過皮下注射Rg1 能夠明顯提高小鼠體內(nèi)乙肝病毒表面蛋白的特異性IgG 及其亞類IgG1、IgG2b的抗體水平，并提高脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ、IL-4mRNA 表達(dá)水平。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，Rg1經(jīng)皮下免疫小鼠后能顯著提高小鼠血清中的卵清蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平，并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)Th1 和Th2 型細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并且其作用機(jī)制與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）信號通路密切相關(guān)[12-13]。但是有關(guān)Rg1的黏膜免疫佐劑活性尚未見報道。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)LTB 和人參皂苷Rg1 聯(lián)合滴鼻免疫能夠明顯提高小鼠血清、陰道灌洗液、支氣管灌洗液和膽汁中的抗原特異性IgA 抗體水平，并顯著增大脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-6mRNA 表達(dá)水平[14]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)LTB 和Rg1聯(lián)合免疫能夠改變白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例，但是不改變白細(xì)胞總數(shù)。這些研究結(jié)果表明，LTB-Rg1作為鼻黏膜復(fù)合佐劑具有較大的發(fā)展空間。

本研究將重組LTB 和人參皂苷Rg1 作為PRRSV滅活疫苗的鼻黏膜復(fù)合佐劑滴鼻免疫小鼠，探究其對PRRSV 疫苗誘導(dǎo)的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用，明確LTB-Rg1作為鼻黏膜復(fù)合佐劑的優(yōu)勢并評估其生物安全性，為進(jìn)一步研制安全有效的黏膜免疫佐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人參皂苷Rg1純度為99.98%，購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；重組LTB 由構(gòu)建的pPIC9KLTB 質(zhì)粒在畢赤酵母GS115 上表達(dá)產(chǎn)生，具體方法參見文獻(xiàn)[9]；動物組織總RNA磁珠提取試劑盒，購自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reation,qRT-PCR）試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM），購自寶生物工程（大連）有限公司；PRRSV抗體檢測試劑盒，購自美國愛德士公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 和IgA 抗體，購自美國Santa Cruz公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、血尿素氮測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒，均購自浙江省寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 病毒

PRRSV JXA-1 毒株在Marc-145 細(xì)胞上培養(yǎng)，檢測到該病毒滴度為1×106TCID50/mL（TCID50為半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）。病毒用0.05%β-丙內(nèi)酯在4 ℃條件下滅活12 h，并在37 ℃條件下繼續(xù)放置2 h。滅活后的病毒接種到Marc-145 細(xì)胞上，連續(xù)盲傳3代，觀察10 d內(nèi)是否有細(xì)胞病變。

1.3 實(shí)驗動物

雌性SPF 級ICR 小鼠（18～20 g）購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司，于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗動物中心飼養(yǎng)，飼喂無菌飼料和水。室內(nèi)溫度為（25±10）℃，相對濕度為（50±10）%。動物實(shí)驗得到浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（2020001）。

1.4 動物分組與處理

將325 只ICR 小鼠隨機(jī)分成5 組，每組65 只。1～5 組小鼠分別滴鼻免疫生理鹽水，PRRSV 滅活抗原（1×105TCID50/只），PRRSV 滅活抗原（1×105TCID50/只）混合LTB（20 μg/只）或Rg1（30 μg/只）或LTB-Rg1（20 μg/只+30 μg/只），每次滴鼻總量為50 μL/只。免疫3 次，分別在實(shí)驗0、7、21 d 進(jìn)行，免疫前通過吸入異氟烷麻醉小鼠。于第1 次免疫（一免）后0、7、14、21、28、35 d稱量小鼠體質(zhì)量；于一免后2、7、21、35 d每組處死5只小鼠，采集血液用于生化檢測；于一免后7、14、21、28、35、42、49、56 d每組處死5 只小鼠，采集血液和支氣管肺泡灌洗液用于檢測小鼠IgG、IgM 和IgA 抗體水平；于一免后35 d每組處死5 只小鼠，采集其脾臟和肺臟并分離單個核細(xì)胞，用于細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測。每只小鼠用1 mL磷酸緩沖鹽溶液灌洗支氣管肺泡，所有樣品保存于－20 ℃冰箱中，備用。

1.5 生化檢測

血液離心后取上清液，分別按照丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、血尿素氮測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒的說明書操作，利用LW C400全自動生化分析儀（廣東省深圳藍(lán)韻醫(yī)療器械公司）檢測。

1.6 特異性IgM、IgG 和IgA 抗體水平的檢測

參考文獻(xiàn)[15]，采用美國愛德士公司生產(chǎn)的PRRSV 抗原包被板，利用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中PRRSV特異性IgM、IgG 和IgA 抗體水平。將100μL 小鼠血清（以體積比1∶100稀釋）或支氣管肺泡灌洗液（以體積比1∶10稀釋）加入包被板中，于37 ℃條件下孵育1 h；洗滌后加入100μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，其中IgM 和IgG 抗體均按體積比1∶5 000 稀釋，IgA抗體按體積比1∶2 000稀釋，室溫下孵育1 h；洗滌后加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，室溫孵育15 min；加終止液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀中測定450 nm波長下的吸光度值。

1.7 細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測

參考文獻(xiàn)[12,16]，采集小鼠脾臟和肺臟組織并分離出單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，并接種到24孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的PRRSV抗原刺激24 h；收集細(xì)胞裂解液，按照動物組織總RNA 磁珠提取試劑盒說明書提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄后利用染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[17]。利用軟件Primer Express 3.0設(shè)計引物序列（表1），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以生理鹽水組為校準(zhǔn)樣本，其他組為待測樣本，采用2－ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用GraphPad Prism 5.0 軟件中的鄧肯多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LTB-Rg1 對PRRSV 特異性IgM 抗體水平的增強(qiáng)作用

由圖1 可知，小鼠滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV后能夠在血清和支氣管肺泡灌洗液中迅速產(chǎn)生較高水平的PRRSV 特異性IgM 抗體。在第1 次免疫（一免）后7 d，LTB-Rg1/PRRSV 組小鼠血清中的特異性IgM 抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.01）；在一免后14 d，除生理鹽水組外其他各組小鼠的血清IgM 抗體水平達(dá)到峰值，其中LTB-Rg1/PRRSV 組的IgM 抗體水平明顯高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001），但與LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV 組相比無明顯差異；在一免后21、28 d，LTB-Rg1/PRRSV組的IgM抗體水平均明顯高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV 組（P＜0.01）。相似的，在一免后7 d，LTB-Rg1/PRRSV 組小鼠支氣管肺泡黏液中的特異性IgM 抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組、LTB/PRRSV 組和Rg1/PRRSV組（P＜0.01）；在一免后14 d，除生理鹽水組外其他各組小鼠的支氣管肺泡黏液中IgM 抗體水平達(dá)到峰值，其中LTB-Rg1/PRRSV 組的IgM 抗體水平明顯 高 于PRRSV 單 獨(dú) 疫 苗 組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組（P＜0.01）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.001），并且這種較高的IgM水平一直維持到一免后35 d。

圖1 小鼠第1次滴鼻免疫后PRRSV特異性IgM抗體水平Fig.1 PRRSV-specific IgM antibody levels after the first intranasal immunization in mice

2.2 LTB-Rg1 對PRRSV 特 異 性IgG 和IgA 抗 體水平的增強(qiáng)作用

由圖2可見，LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高小鼠血清中PRRSV特異性IgG抗體水平和支氣管肺泡黏液中PRRSV特異性IgA抗體水平。在血清IgG抗體反應(yīng)中，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV的小鼠從一免后14 d 開始產(chǎn)生較高水平的IgG 抗體，并在一免后35 d達(dá)到峰值，其抗體水平顯著高于PRRSV單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV 組（P＜0.01）和Rg1/PRRSV 組（P＜0.001），這種較高的IgG 抗體水平一直維持到一免后56 d。在支氣管肺泡IgA抗體反應(yīng)中，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV的小鼠從一免后7 d就開始產(chǎn)生較高水平的IgA 抗體，其抗體水平顯著高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組和Rg1/PRRSV 組（P＜0.05），并且在一免后35 d 達(dá)到峰值，此時抗體水平明顯高于PRRSV 單獨(dú)疫苗組（P＜0.001）、LTB/PRRSV組（P＜0.05）和Rg1/PRRSV組（P＜0.01），這種較高的IgA抗體水平一直維持到一免后56 d。上述結(jié)果表明，LTB-Rg1作為鼻黏膜佐劑對小鼠全身和局部黏膜中的抗原特異性抗體水平均具有較好的增強(qiáng)作用。

圖2 小鼠第1次滴鼻免疫后PRRSV特異性IgG（A1～A3）和IgA（B1～B3）抗體水平Fig.2 PRRSV-specific IgG(A1-A3)and IgA(B1-B3)antibody levels after the first intranasal immunization in mice

2.3 LTB-Rg1 對小鼠脾臟中PRRSV 特異性細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖3可知，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高PRRSV誘導(dǎo)的小鼠脾臟中IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。與PRRSV單獨(dú)免疫組和Rg1/PRRSV組相比，LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.001）和IL-10（P＜0.001）的轉(zhuǎn)錄水平，并且LTB-Rg1/PRRSV組的IFN-γ（P＜0.001）、IL-5（P＜0.001）和IL-10（P＜0.001）轉(zhuǎn)錄水平明顯高于LTB/PRRSV組。

圖3 小鼠滴鼻免疫后脾臟中細(xì)胞因子相對表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of cytokines in spleen after the intranasal immunization in mice

2.4 LTB-Rg1 對小鼠肺臟中PRRSV 特異性細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖4 可見，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠顯著提高PRRSV 誘導(dǎo)的小鼠肺臟中IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。與PRRSV 單獨(dú)免疫組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠明顯提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.01）和IL-10（P＜0.001）的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平；與Rg1/PRRSV 組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV 能夠顯著提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）、IL-2（P＜0.05）、IL-5（P＜0.05）和IL-10（P＜0.01）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；與LTB/PRRSV組相比，滴鼻免疫LTB-Rg1/PRRSV能夠顯著提高小鼠肺臟中IFN-γ（P＜0.001）和IL-5（P＜0.05）的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。這表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1 對小鼠體內(nèi)Th1和Th2型免疫反應(yīng)均有促進(jìn)作用。

圖4 小鼠滴鼻免疫后肺臟中細(xì)胞因子相對表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of cytokines in lung after the intranasal immunization in mice

2.5 LTB-Rg1 對小鼠體質(zhì)量的影響

由圖5 可見，免疫前小鼠的平均體質(zhì)量為（19.14±1.12）g。除PRRSV 單獨(dú)免疫組外，其他各組小鼠的體質(zhì)量在免疫后35 d 內(nèi)持續(xù)增長。LTBRg1/PRRSV 組小鼠的體質(zhì)量與生理鹽水組相比沒有明顯差異，表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1 對小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。在一免后7 d，PRRSV 組小鼠的體質(zhì)量明顯低于LTB-Rg1/PRRSV 組（P＜0.05），但是在一免后14 d又恢復(fù)增長趨勢。

圖5 第1次滴鼻免疫后LTB-Rg1對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of LTB-Rg1 on mice body mass after the first intranasal immunization

2.6 LTB-Rg1 對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

為了解LTB-Rg1 對小鼠的肝腎功能是否有影響，采集小鼠血液并檢測血清中反映肝腎功能狀態(tài)的生化指標(biāo)。由圖6可知，各組小鼠血清中的堿性磷酸酶活力、血尿素氮含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力和葡萄糖含量均無明顯差異，表明鼻黏膜佐劑LTB-Rg1對小鼠的肝功能和腎功能均沒有明顯影響。

圖6 第1次滴鼻免疫LTB-Rg1對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of LTB-Rg1 on serum biochemical indicators in mice after the first intranasal immunization

3 討論

疫苗是目前防控PRRSV的主要手段。但是，市面上的PRRSV 疫苗往往不能提供足夠的免疫保護(hù)作用，特別是交叉免疫保護(hù)作用，使得疫苗防控PRRSV 的效果非常有限。在疫苗中添加合適的免疫佐劑是解決該問題的有效方法之一。對于防御PRRSV感染來說，在呼吸道黏膜快速產(chǎn)生高度特異性的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)具有重要意義。因此，通過鼻黏膜途徑免疫是有效防控PRRSV 較為理想的方法。盡管LTB 已被廣泛用作黏膜免疫佐劑[8,18-19]，但是其通過滴鼻途徑給藥的效果仍然飽受爭議。在早期動物模型研究中，LTB 滴鼻給藥并沒有顯示出任何不良反應(yīng)[19]，但是據(jù)報道人滴鼻LTB后可能會出現(xiàn)短期的Bell麻痹癥狀[20]。一項研究表明，在小鼠腦內(nèi)注射低于22.7μg劑量的LTB并不會對其腦組織造成任何傷害[21]，但是在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)LTB低于30μg劑量注射時并不能充分發(fā)揮其滴鼻佐劑效果[15]。因此，如何在確保安全的前提下發(fā)揮LTB的鼻黏膜佐劑作用是本研究的關(guān)鍵所在。在前期研究中，人參皂苷Rg1 已被證實(shí)具有較好的佐劑效果[12]，但是其黏膜佐劑作用迄今鮮有報道。研究發(fā)現(xiàn)，佐劑的聯(lián)合使用往往比單獨(dú)使用能夠起到更好的免疫效果，因為合適的成分組合可能會使疫苗免疫后機(jī)體內(nèi)Th1和Th2水平調(diào)節(jié)至最適于機(jī)體免疫應(yīng)答的狀態(tài)[22]。在本研究中，將安全劑量的LTB（20μg）和人參皂苷Rg1 聯(lián)合起來作為鼻黏膜復(fù)合佐劑，既能保證LTB的劑量使用安全性，又能協(xié)同發(fā)揮2 種佐劑的免疫增強(qiáng)作用，具有重要的研究價值。

IgA 抗體水平是評價黏膜免疫反應(yīng)的一個重要指標(biāo)[23]；IgM 抗體是機(jī)體接觸抗原后首先產(chǎn)生的抗體，局部黏膜中產(chǎn)生的IgM抗體也被認(rèn)為參與了黏膜免疫應(yīng)答[24]，可作為反映黏膜免疫應(yīng)答水平的指標(biāo)。在本研究中，LTB-Rg1 能夠迅速誘導(dǎo)小鼠呼吸道黏膜和全身產(chǎn)生高水平的特異性IgM抗體，能夠顯著提高小鼠呼吸道黏膜中特異性IgA 和血清中的特異性IgG 抗體水平，并且能夠有效延長這些抗體在局部黏膜和全身的作用時間，與LTB 和Rg1 單獨(dú)佐劑組相比具有優(yōu)勢。傳統(tǒng)的鋁膠佐劑主要偏向于增強(qiáng)Th2 型免疫反應(yīng)，而對Th1 型免疫應(yīng)答沒有明顯作用，這并不適合PRRSV 疫苗。研究表明，豬感染PRRSV 后通常缺乏Th1 型免疫應(yīng)答，這可能會導(dǎo)致免疫抑制反應(yīng)時間延長，隨后出現(xiàn)抗體反應(yīng)變?nèi)酰《狙Y加重以致病情惡化[25-26]。因此，Th1 型免疫應(yīng)答在抵御PRRSV 感染過程中至關(guān)重要。在本研究中，LTB-Rg1 能夠上調(diào)脾臟和肺臟中Th1 型（IFN-γ和IL-2）和Th2 型（IL-5和IL-10）細(xì)胞因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)Th1/Th2 平衡型免疫增強(qiáng)反應(yīng)，對于防御PRRSV 感染具有重要意義。另外，在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)滴鼻免疫LTB-Rg1 僅能夠增強(qiáng)呼吸道黏膜中PRRSV 中和抗體水平，而對血清中的中和抗體水平無明顯影響[15]。值得注意的是，雖然中和抗體水平往往被認(rèn)為是評價免疫保護(hù)作用的一個重要指標(biāo)[27-28]，但是有研究發(fā)現(xiàn)豬在缺乏中和抗體的情況下也可以抵御PRRSV感染[29-30]。因此，免疫系統(tǒng)中可能還存在其他因素可以有效控制感染，比如非中和抗體、T細(xì)胞反應(yīng)等。

在本研究中，免疫小鼠未被觀察到與復(fù)合佐劑相關(guān)的臨床癥狀。在一免后7 d，單獨(dú)疫苗組的小鼠體質(zhì)量明顯下降，但是之后又恢復(fù)正常的增長趨勢，推測可能是免疫應(yīng)激造成的；而添加LTB-Rg1佐劑的小鼠在免疫后體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長，說明該佐劑可能有一定的抗應(yīng)激作用。另外，LTB-Rg1對小鼠的肝腎功能沒有明顯影響。因此，LTB-Rg1是一種比較安全且極具潛力的鼻黏膜免疫佐劑，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為研發(fā)新型PRRSV 滅活疫苗佐劑提供了依據(jù)，也為防控PRRSV提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，滴鼻免疫LTB-Rg1能夠促進(jìn)小鼠血清和呼吸道黏膜表面快速產(chǎn)生較高水平的PRRSV特異性IgM、IgG和IgA抗體，并且能夠有效延長這些抗體的作用時間，顯著上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的小鼠脾臟和肺臟細(xì)胞中Th1和Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。而且該復(fù)合佐劑對小鼠的體質(zhì)量增長和肝腎功能均無明顯影響，是一種比較安全且極具潛力的鼻黏膜免疫佐劑。本研究結(jié)果證實(shí)了該復(fù)合佐劑的優(yōu)勢，為其進(jìn)一步在豬上開展研究奠定了基礎(chǔ)。