鐵飽和度對乳鐵蛋白抑菌活性的影響

王振杰，張康，梁莉，熊晴晴，杜華華

（浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，浙江省飼料與動物營養(yǎng)重點實驗室，杭州 310058）

鐵不僅是動物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，而且是病原微生物生長繁殖的必需營養(yǎng)素。在生豬養(yǎng)殖過程中，由于出生時仔豬體內(nèi)鐵的貯備量少、母豬乳汁中鐵含量低和快速生長需要鐵量較多等矛盾易引起仔豬的缺鐵癥，所以給初生仔豬補鐵是被普遍認可和接受的缺鐵癥預(yù)防或治療手段。然而，在感染情況下，補鐵卻引起了斷奶仔豬的腸道菌群紊亂，加重了仔豬的腹瀉病情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了更大的經(jīng)濟損失[1]。

鐵穩(wěn)態(tài)平衡是動物機體健康的保證。在哺乳動物中，超過70%的鐵以血紅蛋白的形式儲存在紅細胞中，其余的鐵則儲存在巨噬細胞和肝臟中。鐵在體內(nèi)主要以結(jié)合態(tài)存在，其主要儲存形式包括鐵蛋白、含血紅素的蛋白質(zhì)（如細胞色素）、含鐵硫簇的蛋白質(zhì)（如琥珀酸脫氫酶）和其他含鐵蛋白質(zhì)（如2-氧戊二酸依賴性雙加氧酶）[2]。健康動物機體在鐵調(diào)素（hepcidin）的調(diào)節(jié)下能維持鐵的穩(wěn)態(tài)，但這種穩(wěn)態(tài)可以被細菌或病毒感染打破。炎癥信號能誘導(dǎo)鐵調(diào)素的表達增加，從而使血漿中鐵水平下降，引起機體低鐵血癥[3]。在動物機體內(nèi)，細胞外的游離鐵濃度（1×10－18μmol/L）遠遠低于細菌生長所需濃度（1×10－7μmol/L），感染期間游離鐵濃度更低，因此，宿主細胞和病原菌之間經(jīng)常存在鐵競爭[4]。在此過程中，宿主細胞會分泌大量乳鐵蛋白（lactoferrin,Lf）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、嗜鐵素等鐵結(jié)合蛋白，結(jié)合體內(nèi)游離鐵以應(yīng)對細菌的入侵[5]。

Lf最早于1939年在牛奶中被發(fā)現(xiàn)，其在牛奶中的含量特別豐富，也存在于細胞外分泌物如淚液、鼻液、唾液、胰液和胃腸道分泌物中[6]。Lf作為一種鐵結(jié)合蛋白，不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有調(diào)節(jié)免疫、抗菌殺菌、抗癌等多種功能，是新生動物必需的一種安全可靠的營養(yǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。目前已有研究表明，Lf 是嬰兒腸上皮發(fā)育的必需調(diào)節(jié)劑，在腸上皮細胞的增殖分化和腸道免疫活性中發(fā)揮著重要作用[7]。因此，Lf 已成為嬰兒配方奶粉中的主要功能性添加成分，也是一種極具開發(fā)潛力的仔豬飼料添加劑。這其中可能的機制主要包括Lf 能通過促進機體對鐵的吸收和轉(zhuǎn)運，從而改善腸道中微生態(tài)環(huán)境，加強機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高機體的抗氧化性能，增強機體的免疫力[8]。Lf 具有廣譜抗菌能力，一般通過鐵剝奪、膜滲透、酶抑制等途徑抗菌[9]，還能水解為Lf 肽發(fā)揮抗菌作用[10]。但對Lf 本身的鐵飽和度是否影響抗菌能力的研究卻鮮見報道。

根據(jù)Lf中的鐵含量，可以將其分為2種形式，即鐵不飽和乳鐵蛋白（apolactoferrin,Apo-Lf）和鐵飽和乳鐵蛋白（hololactoferrin,Holo-Lf）。本試驗旨在通過研究不同鐵飽和度的豬Lf對細菌生長的影響，重點分析不同鐵飽和度Lf抑菌的機制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為基于Lf 新型抑菌劑的開發(fā)和在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳鐵蛋白的準備

豬乳鐵蛋白（天然乳鐵蛋白）購于德國Hoelzel Diagnostika 公司。采用高效液相色譜法檢測天然Lf 的純度為98.0%，鐵飽和度為22.6%。根據(jù)WANG 等[11]的方法制備Apo-Lf（鐵飽和度為6.9%）和Holo-Lf（鐵飽和度為100.0%）。將3 種不同鐵飽和度的Lf 分別使用無菌水配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的母液，保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.2 抑菌活性試驗

大腸埃希菌K88（Escherichia coliK88）、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（Staphylococcus aureusATCC 25923）、鼠傷寒沙門菌CMCC50013（Salmonella typhimuriumCMCC50013），均購自中國微生物菌種保藏中心（北京）。各細菌在Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中、于37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，以250 r/min離心收集。用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）重懸，調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL。采用分光光度法測定生物濁度以評估Lf 對細菌培養(yǎng)基中液體生長的影響[12]。在LB 液體培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋Lf，將制備好的Lf 工作液加入含有100 μL 細菌溶液的96 孔培養(yǎng)板中，使最終的Lf質(zhì)量濃度達到400.0、200.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL。使用酶標儀檢測不同時間點的D（600 nm）值，以反映各菌株在37 ℃條件下的生長情況。為了證明鐵在Apo-Lf抑菌活動中的作用，于24 h時，在Apo-Lf的LB 液體培養(yǎng)基中添加6.25 μmol/L 次氮基三乙酸鐵，并在48 h時檢測D（600 nm）值。

1.3 電子顯微鏡觀察

分別用Apo-Lf溶液（50.0 μg/mL）和Holo-Lf溶液（50.0 μg/mL）培養(yǎng)濃度為1×103CFU/mL 的細菌24 h。離心得到的細菌用PBS洗滌，之后用2.5%戊二醛固定，再用梯度濃度（30%～100%）乙醇脫水，隨后轉(zhuǎn)移到乙醇/乙酸異戊酯體積比為1∶1 的混合溶液中脫水30 min，然后轉(zhuǎn)移到乙酸異戊酯溶液中脫水1 h。在HCP-2 型臨界點干燥儀（日本Hitachi公司）中用CO2對樣品進行干燥，給處理好的樣品涂上鈀膜，用SU8010型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）觀察細菌的形態(tài)。

1.4 細菌生長試驗

為了確定細菌生長過程中對鐵的需求，用添加或者不添加次氮基三乙酸鐵（含6.25 μmol/L Fe）的低鐵M9培養(yǎng)基（含1.8 μmol/L Fe）培養(yǎng)細菌。在24 h 時，通過測定D（600 nm）值反映各菌株的生長情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，利用SPSS 20.0軟件中的單因子方差分析和t檢驗（t-test）進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.01表示差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的天然乳鐵蛋白對細菌生長的影響

由圖1 可知，Lf 對大腸埃希菌K88 的生長有顯著抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。Lf 濃度越高，對大腸埃希菌的抑制作用越明顯，其中質(zhì)量濃度大于12.5 μg/mL 的Lf 從24 h 開始顯著抑制了大腸埃希菌K88的生長（P＜0.05），并在48 h時達到極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 不同濃度乳鐵蛋白對大腸埃希菌K88生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Lf on the growth of E.coli K88

2.2 不同鐵飽和度的乳鐵蛋白對細菌生長的影響

如圖2所示，與對照組（CK）相比，50.0、200.0 μg/mL Apo-Lf 顯著抑制了大腸埃希菌K88（圖2A）和金黃色葡萄球菌（圖2B）的生長（P＜0.01），但對鼠傷寒沙門菌（圖2C）沒有顯著影響（P＞0.05）。而Holo-Lf對3種細菌的生長均沒有顯著影響（圖2A～C）。為了更好地展示Lf對細菌生長的抑制作用，我們繪制了大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長曲線圖（圖2D～E）。結(jié)果表明，50.0、200.0 μg/mLApo-Lf處理對大腸埃希菌K88的生長具有極顯著的抑制作用（P＜0.01），在120 h 內(nèi)細菌基本不生長（圖2D）。200.0 μg/mLApo-Lf處理也對金黃色葡萄球菌的生長有顯著抑制作用（P＜0.05），但在120 h內(nèi)細菌緩慢生長（圖2E）。然而，Holo-Lf對大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的生長同樣沒有抑制作用，反而有促進細菌生長的趨勢（圖2D～E）。這說明鐵飽和度對Lf的抑菌作用至關(guān)重要，而且Apo-Lf抑制大腸埃希菌K88生長的效果比抑制金黃色葡萄球菌更顯著。

圖2 Apo-Lf和Holo-Lf對細菌生長的影響Fig.2 Effects of Apo-Lf and Holo-Lf on the growth of bacteria

為了進一步確認鐵在Apo-Lf抑制大腸埃希菌生長中的作用，接著開展了補鐵試驗。由圖3可知，被Apo-Lf抑制的大腸埃希菌K88在補鐵之后顯著恢復(fù)了生長（P＜0.01），24 h后其細菌含量甚至超過了對照組。這說明Apo-Lf的抑菌活性主要依賴于低鐵。

圖3 補鐵對Lf處理的大腸埃希菌K88生長的影響Fig.3 Effects of Fe supplement on the growth of Lftreated E.coli K88

由于Apo-Lf 對鼠傷寒沙門菌無顯著影響（圖2C），說明低鐵對鼠傷寒沙門菌的生長影響有限，因此進一步開展了補鐵試驗進行驗證。結(jié)果（圖4）表明：在向低鐵M9培養(yǎng)基中補充6.25 μmol/L Fe之后，大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的數(shù)量均顯著增加（P＜0.01）。但是，補鐵對鼠傷寒沙門菌的生長無明顯影響（P＞0.05）。說明低鐵M9 培養(yǎng)基中的鐵水平已滿足了鼠傷寒沙門菌的生長需要，所以鐵補充對其生長無顯著影響，也提示鼠傷寒沙門菌對鐵的需求量要比大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的更少。

圖4 培養(yǎng)基中的鐵對細菌生長的影響Fig.4 Effects of Fe in the culture medium on the growth of bacteria

2.3 乳鐵蛋白對細菌形態(tài)的影響

掃描電鏡結(jié)果（圖5）顯示：用50.0 μg/mL Lf 處理細菌24 h 后，對照組細菌的表面光滑，形態(tài)特征正常。而用50.0 μg/mL Apo-Lf 處理的大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌表面粗糙，受損嚴重，有些細菌表面甚至出現(xiàn)了裂痕和坑洼，但鼠傷寒沙門菌卻沒有受到明顯影響。同樣，50.0 μg/mL Holo-Lf 處理對3種細菌的表面結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。這些結(jié)果與之前的抑菌結(jié)果一致。

圖5 50.0μg/mLApo-Lf和50.0μg/mL Holo-Lf對細菌形態(tài)的影響Fig.5 Effects of 50.0μg/mL Apo-Lf and 50.0μg/mL Holo-Lf on the morphologies of bacteria

2.4 乳鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

由于Apo-Lf 和Holo-Lf 在抑制大腸埃希菌K88和金黃色葡萄球菌的生長方面表現(xiàn)出了巨大差異，本研究嘗試從二者的結(jié)構(gòu)方面進行解析。利用Uniprot（https://www.uniprot.org/align/）查得豬Lf 的氨基酸序列，使用SWISS-MODEL 構(gòu)建其三維構(gòu)型，得到Lf 的三維結(jié)構(gòu)圖。如圖6 所示：Apo-Lf 在未結(jié)合鐵時呈開放狀態(tài)，該狀態(tài)下Lf的活性部位更容易與細菌表面直接作用。結(jié)合鐵后，Apo-Lf由開放狀態(tài)變?yōu)殚]合狀態(tài)的Holo-Lf，該閉合狀態(tài)不利于活性部位與細菌接觸。

圖6 Apo-Lf和Holo-Lf的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted three-dimensional structures of Apo-Lf and Holo-Lf

3 討論與結(jié)論

Lf對鐵具有很強的親和力，本研究證明了不同鐵飽和度的Lf 對細菌生長的抑制作用存在很大差異。Apo-Lf 能夠有效抑制大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長，而Holo-Lf 對這2 種細菌并無此作用。為證明缺鐵可抑制細菌生長，本研究采用在低鐵培養(yǎng)基中補充鐵的試驗，結(jié)果表明低鐵培養(yǎng)基的確能夠在一定程度上限制細菌生長。而且，在Apo-Lf 抑菌試驗中添加鐵能消除Apo-Lf 的抑制作用，說明Apo-Lf 具有較強的鐵結(jié)合能力，其抑菌作用在很大程度上基于競爭性地結(jié)合了細菌生長所需要的鐵元素。前人的研究也發(fā)現(xiàn)，天然Lf 和Apo-Lf 能不同程度地抑制19 種細菌的生長，而Holo-Lf 卻不能抑制這些細菌[13]。Apo-Lf 能夠抑制變形鏈球菌6715-13 的生長，但加入Holo-Lf 后抑菌效果消失[14]。本研究結(jié)果和前人的結(jié)論都表明，只有低鐵飽和度的Lf能夠抑制細菌生長，天然Lf和Apo-Lf 的鐵結(jié)合能力要強于鐵飽和的Holo-Lf。同時，在胞外游離鐵被限制的情況下，許多細菌已經(jīng)進化出從Holo-Lf中獲取鐵的機制。例如一些細菌表面的特異性Lf受體可以與Lf結(jié)合來獲取Lf中的鐵[15]。這也可能是Apo-Lf能夠抑制這2種細菌，而Holo-Lf不能發(fā)揮抑菌作用的原因。但也有報道指出，牛Apo-Lf和Holo-Lf都可以抑制小鼠體內(nèi)的金黃色葡萄球菌，并且不同鐵飽和度的牛Lf的抑菌活性都是相似的[16]。這可能與Lf的種類、細菌的種類以及添加Lf的方式有關(guān)。

本研究通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，用Apo-Lf 處理過的大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌菌體表面均出現(xiàn)了不同程度的破損，而對照組和Holo-Lf 處理組則均未出現(xiàn)此情況。這說明Apo-Lf 能在一定程度上破壞大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的表面結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與其有效抑制細菌生長的試驗結(jié)果一致。BRANDENBURG 等[17]發(fā)現(xiàn)在細胞外鐵過量的情況下，Lf 可以直接與一些細菌的表面結(jié)合，發(fā)揮不依賴于鐵的抑菌作用。這種功能可能與Lf 自身的大量正電荷與細菌成分相互作用有關(guān)，也可能與Lf 利用N 端葉蛋白酶樣活性裂解富含精氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)從而減弱細菌毒力有關(guān)[18-19]。當然，本研究中Apo-Lf 表現(xiàn)出的破壞細菌膜的作用可能更大程度上依賴于其結(jié)構(gòu)。通過對Lf 的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，豬Lf在不同的鐵飽和度情況下的結(jié)構(gòu)有很大差異。與Holo-Lf 相對閉合的結(jié)構(gòu)相比，Apo-Lf 的結(jié)構(gòu)更開放、更延展。鐵飽和時Lf 的構(gòu)象變化可能會干擾Lf 殺菌區(qū)域與細菌表面的相互作用，減弱其抑菌活性，而Apo-Lf 開放的結(jié)構(gòu)可能更容易展示其殺菌位點，可以更好地與細菌表面相互作用，這表明Apo-Lf 構(gòu)象可能也是它發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵。這一結(jié)果與ANDERSEN 等[20]報道的人Lf晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。

本研究首次直接證明了豬Apo-Lf 一方面可以通過結(jié)合鐵的方式抑制大腸埃希菌K88 和金黃色葡萄球菌的生長，另一方面也可以利用其開放的構(gòu)象、有效破壞細菌膜的方式來抑菌，這為開發(fā)基于Lf 的抑菌制劑提供了理論依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，如Apo-Lf 未能抑制鼠傷寒沙門菌的原因還不清楚，不同鐵飽和度的豬Lf在體內(nèi)對細菌的抗菌作用仍有待繼續(xù)探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低鐵飽和度的Lf能夠結(jié)合鐵，競爭性地奪取細菌所需鐵而發(fā)揮抑菌作用；低鐵飽和度的Lf能夠破壞細菌菌體的表面膜結(jié)構(gòu)，而鐵飽和的Lf則無此功能；低鐵飽和度的Lf三維結(jié)構(gòu)更開放，有利于展示其活性位點。