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    MiR-506-3p與自噬相關(guān)因子在燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究

    2022-07-12 15:59:38史敏丁欣強(qiáng)郭曉波陳煒熒張明雨
    中國美容醫(yī)學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:微小RNA自噬

    史敏 丁欣強(qiáng) 郭曉波 陳煒熒 張明雨

    [摘要]目的:分析燒傷組織中miR-506-3p的表達(dá)及其對自噬水平的調(diào)控。方法:提取正常皮膚組織、燒傷皮膚組織和熱處理成纖維細(xì)胞細(xì)胞的總RNA,采用熒光定量RT-qPCR、Western Blot分別檢測各細(xì)胞miR-506-3p和自噬相關(guān)因子(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ)表達(dá)水平;采用同樣方法檢測miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到真皮成纖維細(xì)胞中對上述自噬相關(guān)因子表達(dá)水平的影響,并利用CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖效率。結(jié)果:與正常組織相比,燒傷組織和熱處理成纖維細(xì)胞中,miR-506-3p的表達(dá)下調(diào),自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及Collagen Ⅰ的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),而p62表達(dá)下調(diào)(P<0.05);miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到皮膚成纖維細(xì)胞中,miR-506-3p表達(dá)顯著降低,促進(jìn)了細(xì)胞增殖和自噬發(fā)生,而miR-506-3p的過表達(dá)則顯示出相反的作用(P<0.05)。結(jié)論:miR-506-3p在燒傷皮膚組織恢復(fù)中發(fā)揮著積極作用,對調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的自噬水平具有重要作用,有可能成為燒傷愈合后瘢痕潛在治療的靶標(biāo)。

    [關(guān)鍵詞]熱損傷;真皮成纖維細(xì)胞;微小RNA;自噬;瘢痕形成

    [中圖分類號]R334+.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455(2022)05-0086-04

    Expression of MiR-506-3p and Autophagy-related Factors in Post-burn Skin Fibroblasts

    SHI Min1,DING Xinqiang2,GUO Xiaobo3,CHEN Weiying1,ZHANG Mingyu1

    (1.School of Medicine,Xi’an Peihua University,Xi’an 710125,Shaanxi,China; 2.Department of Dermatology,Xi'an Children's Hospital,Xi’an 710003,Shaanxi,China; 3.Clinical Laboratory,Xi’an Central Hospital,Xi’an 710003,Shaanxi,China)

    Abstract: Objective To analyze the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and its regulation of autophagy. Methods To extract the total RNA of normal skin tissue, burned tissue and heat treatment into fibroblast cells, using fluorescent quantitative RT-QPCR, Western Blot, respectively, detects mIR-506-3p and autophagy-related factors(LC3-II/I ratio, Atg5, p62 and Collagen I) in post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts, RT-qPCR was also used to detect the effect of miR-506-3p mimic or miR-506-3p inhibitor transfected into dermal fibroblasts on the expression of autophagy-related factors, and CCK-8 method was used to detect the proliferation efficiency of transfected cells. Results Compared with normal tissues, in post-burn tissues and heat-treated fibroblasts, the expression of miR-506-3p was down-regulated, and the expression of autophagy-related factors, such as LC3-II/I ratio, Atg5 and Collagen I, were significantly up-regulated, while the expression of p62 was down-regulated. When miR-506-3p inhibitors were transfected into dermal fibroblasts, the expression of miR-506-3p was significantly down-regulated, which could promote cell proliferation and autophagy, while the overexpression of miR-506-3p showed the opposite effect. Conclusion MiR-506-3p plays an positive role in the recovery of post-burn skin, and plays an important role in regulating the autophagy level of fibroblasts,it may be a potential target for post-burn scar treatment.

    Key words: thermal damage; dermal fibroblasts; micro-RNA; autophagy; scar formation

    皮膚在燒傷后的修復(fù)過程中有多種類型的細(xì)胞參與,其中最重要的是真皮成纖維細(xì)胞,其通過分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[1],其中微小RNA(miRNA)參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)并影響著人增生性瘢痕的形成[2]。此外,研究表明自噬與病理性瘢痕等纖維化疾病密切相關(guān),miRNA在多個自噬通路中扮演著關(guān)鍵角色,如在腎臟缺血再灌注損傷時miR-21可抑制細(xì)胞自噬,促進(jìn)腎臟纖維化和膠原的合成,給予miR-21抑制劑可增加自噬因子LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá),減輕腎纖維化損傷[3]。本課題組前期研究證實(shí)了miR-21通過調(diào)節(jié)人瘢痕成纖維細(xì)胞中PTEN的表達(dá)影響成纖維細(xì)胞增殖[4]。本次研究擬探討瘢痕形成中miR-506-3p表達(dá)及對自噬相關(guān)因子LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的調(diào)控機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1? 材料和方法

    1.1 標(biāo)本收集:收集2018年4月-2019年5月在西安市兒童醫(yī)院皮膚科就診的30例燒傷患者燒傷后24 h內(nèi)的皮膚樣本,燒傷深度為Ⅱ度或Ⅲ度,將每例患者的燒傷皮膚組織和鄰近正常對照皮膚組織標(biāo)本儲存于–80℃液氮中,以備研究。樣本取材前征得患者本人或家屬知情同意,所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?;颊咝g(shù)前1年內(nèi)未接受任何相關(guān)藥物治療,且無腫瘤病史。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:人皮膚成纖維細(xì)胞系HSAS4和人胚腎293T(HEK293T)細(xì)胞源自空軍軍醫(yī)大學(xué);DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自HyClone公司;miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應(yīng)的陰性對照購自RiboBio公司;基因過表達(dá)載體(Ad-Beclin-1)和對照載體購自GenScript Biotech公司;PrimeScript RT試劑盒和Mir-XTM miRNA第一鏈合成試劑盒購自大連塔卡拉生物科技有限公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、SYBR PrimeScript? miRNA RT-PCT試劑盒及7900HT實(shí)時PCR系統(tǒng)購自美國Biosystems公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、熱處理模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)染:將HSAS4和HEK293T細(xì)胞在37℃ 5%CO2環(huán)境下培養(yǎng),10%胎牛血清DMEM為含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的抗生素混合物。將HSAS4細(xì)胞培養(yǎng)物放入熱水器槽中,在52℃下孵育30 s,然后在正常條件下孵育,建立細(xì)胞熱處理模型,以模擬燒傷狀態(tài)。將熱處理后的HSAS4細(xì)胞以104個/孔的密度接種到六孔板中,根據(jù)說明書采用Lipofectamine 2 000質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。MiR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑和相應(yīng)的陰性對照(NC模擬物和NC抑制劑)分別轉(zhuǎn)染至HSAS4細(xì)胞,24 h后更換培養(yǎng)基。

    1.3.2 RNA提取和RT-qPCR分析:用Trizol試劑分別提取正常皮膚組織、燒傷皮膚組織和轉(zhuǎn)染后HSAS4細(xì)胞的總RNA。反轉(zhuǎn)錄按照Prime Script RT試劑盒和Mir-XTM miRNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行操作。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過7900HT RT-PCR系統(tǒng)來測量mRNA和miRNA的12 h、24 h、48 h的表達(dá)水平,并進(jìn)行比較?;蛱禺愋砸镞x用miR-506-3p和β肌動蛋白。獨(dú)立操作至少重復(fù)3遍,使用相對定量2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。

    1.3.3 CCK-8細(xì)胞增殖檢測:CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染48 h后的HSAS4細(xì)胞增殖效率,利用微孔板在0 h、24 h和72 h分別讀取細(xì)胞增殖效率。以1.0×105個細(xì)胞/孔的密度將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于六孔板,并將100μl無FBS的培養(yǎng)基和8μl CCK-8添加至每孔中,于黑暗中孵育2 h。之后在每個特定的時間點(diǎn)(0 h、24 h和72 h)通過測量吸光度(450 nm)檢測細(xì)胞增殖水平。此過程重復(fù)3遍以上。

    1.3.4 Western Blot檢測:將RIPA裂解緩沖液分別從正常組織、燒傷后皮膚組織和轉(zhuǎn)染的HSAS4細(xì)胞中獲得總蛋白裂解物,再用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品蛋白并轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h,隨后將膜和以下第一抗體分別在4℃下過夜孵育:LC3B(1︰300),p62(1︰400),Atg5(1︰300),LH2(1︰500)和CollagenⅠ(1︰800)。β肌動蛋白被設(shè)置為內(nèi)源性對照物。最后將膜與第二抗體IgG再在室溫下孵育2 h。顯影曝光后,用ECL-Plus Western Blot系統(tǒng)分析靶基因的相對表達(dá)水平。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍以上。

    1.4 觀察指標(biāo):采用熒光定量RT-qPCR、Western Blot檢測正常皮膚組織、燒傷組織和熱損傷HSAS4細(xì)胞、正常皮膚成纖維細(xì)胞的miR-506-3p和自噬相關(guān)因子(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ)表達(dá)水平;采用RT-qPCR檢測miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中對上述自噬相關(guān)因子表達(dá)水平的影響;利用CCK-8方法檢測轉(zhuǎn)染HSAS4細(xì)胞增殖效率。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)至少獲得3次數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間比較進(jìn)行配對t檢驗(yàn),兩組以上使用單向方差分析,P<0.05顯示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2? 結(jié)果

    2.1 正常皮膚組織和燒傷組織中miR-506-3p、LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的表達(dá):30例患者正常組織及燒傷組織樣本采用RT-qPCR檢測miR-506-3p的表達(dá)水平。燒傷組織中miR-506-3p的表達(dá)水平較正常組織下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1;同時,在燒傷組織中,自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也顯著上調(diào),而p62的表達(dá)則下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

    2.2 正常皮膚成纖維細(xì)胞和熱損傷HSAS4細(xì)胞中miR-506-3p以及自噬相關(guān)因子的表達(dá):結(jié)果表明,不同時段熱損傷HSAS4細(xì)胞的miR-506-3p的表達(dá)低于正常皮膚成纖維細(xì)胞,且在48 h時熱損傷HSAS4細(xì)胞的miR-506-3p表達(dá)下調(diào)最為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。不同時段熱損傷HSAS4細(xì)胞中自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也顯著上調(diào),而p62的表達(dá)則下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    2.3 miR-506-3p對熱損傷HSAS4細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及自噬相關(guān)因子表達(dá)的影響:在熱刺激條件下,將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中,以實(shí)現(xiàn)miR-506-3p過表達(dá)或低表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果表明,通過miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染可顯著降低miR-506-3p表達(dá),而通過miR-506-3p模擬物轉(zhuǎn)染可提高miR-506-3p的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到HSAS4細(xì)胞中,自噬相關(guān)因子的檢測結(jié)果表明,抑制miR-506-3p促進(jìn)了自噬(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和Atg5上升,p62降低)和CollagenⅠ表達(dá),而miR-506-3p的過表達(dá)則顯示出相反的作用,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖6。

    2.4 miR-506-3p對熱損傷HSAS4細(xì)胞增殖能力的影響:CCK-8分析表明,抑制miR-506-3p可顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力,而miR-506-3p過表達(dá)則減少了細(xì)胞增殖,見圖7。

    3? 討論

    病理性瘢痕形成是創(chuàng)傷修復(fù)的產(chǎn)物,主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)CollagenⅠ、Ⅲ聚集。越來越多的證據(jù)表明,miRNA與細(xì)胞自噬及增生性瘢痕的關(guān)系密切[5]。miRNA對皮膚組織成纖維細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞行為具有重要作用,Liu等[6]證實(shí)miR-181b-5p通過調(diào)節(jié)MEK/ERK/p21途徑促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。另外,有研究顯示miR-506可影響人類不同疾病的細(xì)胞生長、分化、癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲,如宮頸癌[7]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[8]及肺纖維化[9]等。本次研究表明,在燒傷的皮膚組織和熱損傷的皮膚成纖維細(xì)胞中,miR-506-3p表達(dá)顯著下調(diào)。成纖維細(xì)胞增殖異常是瘢痕組織過度生長和持續(xù)存在的主要原因[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),熱刺激皮膚成纖維細(xì)胞miR-506-3p過表達(dá)顯著降低了細(xì)胞的增殖能力,提示miR-506-3p在燒傷皮膚的愈合及瘢痕形成中發(fā)揮著重要作用。

    自噬是細(xì)胞的一種程序性死亡方式,對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的再利用及穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。自噬與病理性瘢痕等纖維化疾病密切相關(guān)[11],其通過參與成纖維細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、細(xì)胞因子的分泌等,在瘢痕形成的各階段發(fā)揮著不同作用。越來越多的證據(jù)表明,miRNA參與調(diào)控自噬的發(fā)生,在多個自噬通路中扮演著關(guān)鍵性角色,如慕生枝等[12]發(fā)現(xiàn)miR-203過表達(dá)可抑制人瘢痕成纖維細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能是通過靶向抑制ΔNp63的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)P53的蛋白表達(dá);Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miR-30a通過靶向Beclin-1來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的自噬;盧新星等[14]發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞miR-21過表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化,降低LC3-Ⅱ表達(dá)和增加p62水平,降低自噬水平而減少細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)堆積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常皮膚組織相比,燒傷組織和熱損傷皮膚的成纖維細(xì)胞中miR-506-3p的表達(dá)均下調(diào),自噬相關(guān)因子(如LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ)顯著上調(diào),而p62的表達(dá)則下調(diào),表明自噬水平上調(diào),說明熱刺激促進(jìn)了真皮成纖維細(xì)胞中的自噬。

    為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-506-3p調(diào)控自噬水平的能力,筆者將miR-506-3p模擬物或miR-506-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到真皮成纖維細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)miR-506-3p過表達(dá)或低表達(dá),通過檢測自噬相關(guān)因子來反映自噬水平。結(jié)果顯示,抑制miR-506-3p表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞自噬并增加CollagenⅠ表達(dá),而miR-506-3p的過表達(dá)則顯示出相反作用,提示自噬在燒傷組織發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,也進(jìn)一步揭示miR-506-3p能夠負(fù)性調(diào)控自噬水平,具體的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,燒傷組織和熱損傷的成纖維細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)下調(diào),自噬水平上調(diào),miR-506-3p過表達(dá)可抑制皮膚成纖維細(xì)胞的自噬和增殖,提示miR-506-3p有可能成為燒傷愈合后瘢痕潛在的治療靶標(biāo)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [收稿日期]2021-02-04

    本文引用格式:史敏,丁欣強(qiáng),郭曉波,等.MiR-506-3p與自噬相關(guān)因子在燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2021,31(5):86-89.

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