雙酚A誘發(fā)卵巢儲備功能下降大鼠模型的制備及其中醫(yī)證候屬性

秦秀云，張蕾，鄭敏，張建偉

1 日照市婦幼保健院中醫(yī)科，山東日照 276800；2 山東中醫(yī)藥大學第一臨床學院；3 日照市婦幼保健院婦科；4 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合生殖與遺傳中心

卵巢儲備功能下降（DOR）是指卵巢內存留的可募集的卵泡數(shù)量和（或）卵母細胞質量下降，臨床表現(xiàn)以月經(jīng)異常、不孕癥和圍絕經(jīng)期類不適為主［1］。該病發(fā)病率逐年升高，且有低齡化發(fā)展趨勢［2］，若不及早進行有效干預，可在1～5年發(fā)展為卵巢早衰［3］，是婦科領域研究的熱點和難點之一。雙酚A（BPA）是當前環(huán)境普遍存在的環(huán)境污染物［4］，現(xiàn)有研究證實其對卵巢功能有不利影響［5］。2018 年5 月—2021 年12月，本團隊擬在此基礎上構建一種新的DOR病證結合動物模型并分析其證候屬性，以期為進一步挖掘中醫(yī)藥對抗環(huán)境污染、保護女性生育力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF 級雌性清潔SD 大鼠：3 月齡45 只，體質量245～270 g；6 月齡30 只，體質量290～310 g；均購自濟南朋悅動物實驗有限公司，動物許可證編號［SYXK（魯）20170022］，未交配，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗室動物中心，自由攝食、飲水。保持室溫23～25 ℃，相對濕度50～60%。檢疫間適應性喂養(yǎng)1 周。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核通過，倫理批件號：AWE-2019-045。BPA（美國Sigma 公司），玉米油（北京索萊寶科技有限公司），ELISA 檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限司）。本實驗所用中藥配方顆粒均購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥房。顯微鏡（日本，OLYMPUS），電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，切片機、包埋機（武漢俊杰電子有限公司）。

1.2 DOR模型制備方法篩選

1.2.1 動物分組及DOR 模型制備 選擇動情周期規(guī)律［6］的3 月齡和6 月齡清潔SD 大鼠各18 只，不同月齡分別按隨機數(shù)字表法進行分組，分為3或6月齡BPA 低劑量組、3或6月齡BPA 中劑量組、3或6月齡BPA 高劑量組。每組各6 只。大鼠每3 日稱重1 次。BPA低、中、高劑量組分別每日給予50、100、200 mg/kg的BPA 混懸液灌胃［7］。各組均每日灌胃1 次，參考文獻［8］以大鼠動情周期紊亂、FSH 與LH 升高，原始卵泡減少，閉鎖卵泡增加為造模成功；并選擇觀察指標變化最明顯組所用的模型制備方法為最佳方法。

1.2.2 大鼠一般情況觀察 觀察大鼠被毛、自主活動、肛溫、飲水量和大便性狀。

1.2.3 動情周期紊亂評估 每日上午9：00 進行陰道涂片觀察大鼠動情周期。操作者左手固定大鼠，充分暴露陰道口，右手將提前蘸有生理鹽水的消毒棉簽輕輕旋轉插入大鼠陰道內約0.5 cm，旋轉1~2周后取出；將帶有陰道內容物的棉簽在事先準備好的載玻片上涂一0.5 cm×0.5 cm 均勻薄層，涂片過程中注意同時轉動棉棒2周以保證涂片與實際周期相符。正常性成熟大鼠動情間期、動情前期、動情期和動情后期交替規(guī)律出現(xiàn)，若動情周期延長7 d及以上，或無明顯周期，持續(xù)處于動情間期，或動情期延長至3 d及以上，視為動情周期紊亂［9］。

1.2.4 血清促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、抗苗勒氏管激素（AMH）、抑制素-B（INHB）檢測 3、6月齡大鼠確定動情周期紊亂即處死；造模成功的18只大鼠干預2周后同時處死。擬處死大鼠16時禁食水，次日上午9時10%水合氯醛麻醉后快速開腹，暴露腹主動脈，取腹主動脈血5 mL靜置30 min，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），移取血清于1.5 mL EP管，凍存于-80 ℃冰箱，用ELISA法檢測血清FSH、LH、E2、AMH、INHB。

1.2.5 卵巢組織形態(tài)觀察及各級卵泡比例、卵巢指數(shù)測算 采血后，恢復臟器生理位置，找到“Y”型大鼠子宮，沿雙側輸卵管向上找到卵巢，小心分離卵巢，快速用電子天平稱取卵巢濕重并記錄，置于無菌

1.5 mL EP 管，密封，做好標記保存于液氮中，轉移至-80 ℃冰箱凍存送檢。每只大鼠取雙側卵巢稱重，取左側卵巢組織進行石蠟切片和HE 染色，顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)和各級卵泡比例［10］。藥物干預后計算卵巢指數(shù)，卵巢指數(shù)=雙側卵巢濕重／處死前大鼠體質量×100%。

1.3 以方測證方法 選擇18 只最優(yōu)DOR 模型大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、右歸丸組、養(yǎng)精種玉湯組，每組6 只。將治療腎陽虛的右歸丸顆粒配制成濃度為0.189 g/mL 混懸液，治療腎陰虛的養(yǎng)精種玉湯顆粒配制成濃度為0.403 g/mL 混懸液。對照組、右歸丸組、養(yǎng)精種玉湯組分別給予蒸餾水、右歸丸組、養(yǎng)精種玉湯按1 mL/100 g體質量灌胃，連續(xù)2 周。所有大鼠每日稱重后調整藥量。動情周期變化、卵巢組織形態(tài)和卵巢指數(shù)、血清性激素、INHB、AMH水平和各級卵泡觀察及方法同上。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料用±s表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DOR模型制備結果

2.1.1 各組一般情況 各BPA 干預組大鼠活動減少，喜蜷臥扎堆，被毛稀疏，無光澤，飲水量減少，大便稀。

2.1.2 各組動情周期紊亂時間比較 3 月齡BPA低、中、高劑量組動情周期紊亂時間分別為（41.8 ±12.5）、（15.0 ± 2.4）、（36.3 ± 10.4）d；6 月 齡BPA低、中、高劑量組動情周期紊亂時間分別為（39.3 ±9.9）、（34.5±11.4）、（36.6±12.6）d。與其他組比較，3月齡BPA中劑量組動情周期紊亂時間短（P均＜0.01）；6 月齡各組間動情周期紊亂時間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.1.3 各組激素、INHB和AMH水平比較 各組激素、INHB和AMH水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），但3 月齡BPA 中劑量組AMH 水平最低。見表1。

表1 各組激素、INHB和AMH水平（±s）

表1 各組激素、INHB和AMH水平（±s）

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2.1.4 各組各級卵泡比例比較 各組各級卵泡比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），但3月齡中劑量組原始卵泡最少，閉鎖卵泡最多。見表2。

表2 各組各級卵泡比例（%，±s）

表2 各組各級卵泡比例（%，±s）

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2.2 DOR模型以方測證結果

2.2.1 各組動情周期變化 模型組大鼠實驗期間持續(xù)處于動情周期紊亂狀態(tài)，養(yǎng)精種玉湯組大鼠有1只恢復規(guī)律動情周期，右歸丸組有5只大鼠恢復規(guī)律動情周期。

2.2.2 各組卵巢組織形態(tài)和卵巢指數(shù)比較 模型組大鼠卵巢蒼白，體積變小，質地硬，右歸丸組大鼠卵巢顏色紅潤，體積變大，組織彈性好，表面有多個生長卵泡，養(yǎng)精種玉湯組大鼠卵巢顏色較模型組紅潤，表面生長卵泡少，組織彈性差（見圖1）。模型組、右歸丸組、養(yǎng)精種玉湯組卵巢指數(shù)分別為1.95 ±0.20、2.46±0.44、2.11±0.27。與模型組比較，右歸丸組卵巢指數(shù)高（P＜0.05），養(yǎng)精種玉湯組無明顯改善（P＞0.05）。

注：圖A模型組；圖B右歸丸組；圖C養(yǎng)精種玉湯組。

2.2.3 各組激素、INHB、AMH水平比較 與模型組比較，右歸丸組FSH水平低，LH、INHB、AMH水平高（P均＜0.05）；養(yǎng)精種玉湯組激素、INHB、AMH水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。與養(yǎng)精種玉湯組比較，右歸丸組LH、INHB、AMH水平高（P均＜0.05）。各組E2水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清激素、INHB、AMH水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清激素、INHB、AMH水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與養(yǎng)精種玉湯組比較，▲P＜0.05。

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2.2.4 各組各級卵泡比例比較 見表4。

表4 各組各級卵泡比例比較（%，±s）

表4 各組各級卵泡比例比較（%，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與養(yǎng)精種玉湯組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

DOR 可導致育齡婦女過早出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)并伴隨不孕，降低輔助生殖技術的成功率，盡早干預會避免其繼續(xù)發(fā)展成卵巢早衰［11］。臨床實踐表明，中醫(yī)藥治療DOR 具有很好的臨床療效［12］，但探討DOR 的病因病機和中醫(yī)藥作用機制需要動物模型的支持［13］。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論的指導下，結合現(xiàn)代動物實驗技術，研究符合中醫(yī)理論的動物模型，才能用于闡明中醫(yī)理論內涵，驗證評價中醫(yī)藥療效。病證結合模型研究中如何將患者的主觀癥狀與動物表達相匹配仍是當前最大難題。病證結合動物模型應該與人的生理、病理過程接近，符合中醫(yī)病因特點，刺激條件可控可量化，誘因無創(chuàng)或微創(chuàng)；可通過特定的實驗室診斷、儀器診斷和病理診斷、客觀化的證候指標評價對動物模型進行評價［14］。目前應用較普遍的DOR 動物模型是雷公藤多苷［15］、環(huán)磷酰胺［16］、順鉑［17］、去氧乙烯基環(huán)己烯（VCD）［18］等造模法，這些方法造模簡便，成熟，穩(wěn)定性好，可重復性強；但其局限性在于僅代表了臨床中部分患者發(fā)病過程，還有部分患者并無基礎疾病或其他明顯病因而發(fā)生DOR，研究更為廣泛代表本病發(fā)病過程的病證結合模型很有必要。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DOR 在IVF 人群中所占比例越來越高，且有年輕化趨勢［19］。

DOR 模型大鼠以動情周期發(fā)生紊亂［8］，并以動情周期延長為主要表現(xiàn)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同月齡不同劑量BPA 干預均會導致大鼠DOR，3 月齡中劑量組的成模時間相對集中，離散程度小，在實驗操作上可行性最高。3 月齡BPA 低、中、高劑量組間FSH、LH、E2、INHB 均無明顯差異，但3 月齡中劑量組AMH 水平和原始卵泡最低，閉鎖卵泡最多。另外，3 月齡SD 大鼠是目前最易獲得的實驗動物，各實驗動物公司均可提供，無需定制，降低了實驗成本，增加了實驗可控性。因此選擇3 月齡SD 大鼠以每天100 mg/kg劑量BPA混懸液灌胃制備DOR模型是科學可行的造模方法。

歷代醫(yī)家認為生育能力的下降與腎密切相關，腎陽乃一身陽氣之本，腎陽虛衰，溫煦功能下降，可見弓背、蜷縮、耐寒能力下降；腎陽不足，脾失溫煦，則大便稀溏；腎主生殖，腎虛，腎中陰陽失調，沖任受損，月經(jīng)失調而致不孕。本研究中模型組大鼠卵巢功能下降，伴有體質量下降，飲水量減少，大便稀溏，活動能力下降等表現(xiàn)，提示該動物模型證候特點偏腎陽虛型，為進一步明確該結論，本研究運用以藥測證（反證）的方法進一步研究。盡管有一定的局限性，“以方測證”是當前中醫(yī)證本質及證模型研究應用最廣泛的方法［21］，在腎主生殖理論指導下，采用經(jīng)典方劑進行驗證并多層次、多指標相結合增加了研究的科學性［22］。本研究選擇中醫(yī)學經(jīng)典的治療腎陽虛的右歸丸與治療腎陰虛的養(yǎng)精種玉湯進行模型大鼠的中醫(yī)證候屬性評價。結果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠經(jīng)右歸丸干預后體質量明顯增加，飲水量增加，大便性狀改善，活動能力提高，F(xiàn)SH 降低，INHB 和AMH 上升，卵巢指數(shù)增加，原始卵泡明顯增加，閉鎖卵泡明顯減少，生育能力提高；而養(yǎng)精種玉湯組變化不明顯。說明溫陽補腎能明顯改善DOR 大鼠卵巢功能，增加卵巢儲備，減少卵泡閉鎖，效果優(yōu)于滋陰補腎法。以方測證結果表明該大鼠模型屬于腎陽虛型。

與其他常用造模方法比較，本造模方法優(yōu)勢在于探討了當前部分無基礎疾病或明顯誘因的DOR人群致病因素，該致病因素作用于動物表現(xiàn)的外觀行為和生理病理改變與臨床部分病例發(fā)病過程相似；結果可逆，通過中藥干預，尤其是右歸丸組大鼠DOR 癥狀體征明顯改善，符合病證結合動物模型研究標準。